正交试验法优选光明护眼凝胶膏贴剂中总黄酮类成分提取工艺

司云珊 翟宏业 王 玉 马 力 耿 琍

吉林省中医药科学院，吉林长春 130000

光明护眼凝胶膏贴剂是由青箱子和决明子等组成，具有清热明目、清利头目、明目退翳作用，用于缓解视疲劳症状（又称视疲劳综合征，visual display terminal，VDT）的保健用品。视疲劳又称眼疲劳，是一种眼科常见病，其所引起的眼干、眼涩、眼酸胀、视物模糊甚至视力下降直接影响着人的工作与生活。眼疲劳主要是由于人们平时全神贯注看电视，电脑等电子产品屏幕时眼睛眨眼次数减少，闪烁屏幕强烈刺激眼睛而引起的，眼疲劳还会引发和加重各种眼病[1]。总黄酮提取和含量测定方法的研究一直是植物复方总黄酮研究的热点问题，传统的提取法有回流提取法、超声波提取法等，还有醇类提取法、碱液提取法、系统溶剂提取法、微波加热提取法。测定法有紫外分光光度法、液相色谱法、毛细管电泳法。紫外分光光度法相对简单、快捷、价格低廉，样品又可回收使用，是鉴定总黄酮类化合物的一种重要手段，笔者拟在考察影响总黄酮提取率单因素实验的基础上，采用正交设计进一步优化提取工艺，为复方的综合利用提供依据。本研究采用正交试验法优选光明护眼凝胶膏贴剂的提取工艺[2]，为本方进一步开发成凝胶膏剂提供实验依据[3]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

尤尼柯UV2800紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器公司）；Rephile一体式超纯水机（Rephile Bioscience公司）；KQ-100DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；YP1002－电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；Al204电子天平（上海越平仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；FW100小型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，100080-201408）。乙醇（北京化工厂，分析纯）；亚硝酸钠（天津科密欧化学试剂有限公司）。

本实验所用药材由长春中东健康万家药业有限责任公司提供，各药材依照《2015版中华人民共和国药典》项下规定自检接符合规定，为本文实验过程用药。

2 方法与结果

2.1 标准溶液的配制

精密称取芦丁标准品适量，精密称定90%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每毫升含0.63 mg芦丁对照品溶液，备用。

2.2 最大吸收波长的选择

精密量取芦丁对照品5 ml，样品溶液1ml，芦丁加入10 ml甲醇再加1%三乙胺溶液定容至25 ml，样品溶液加入7 ml纯化水，再加1%三乙胺溶液定容至25 ml。以溶液为空白，在190～800 nm波长范围内扫描，芦丁标准品与供试品均在360 nm处有最大吸收波长，见图1。结果表明在此试验条件下测定最大吸收波长为360 nm，故本实验测定波长为360 nm。

图1 芦丁紫外-可见吸收全波长扫描图

2.3 标准曲线的建立

精密称取芦丁对照品10.298 mg于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取此溶液于10 ml容量瓶中，配成浓度为0、5、10、15、20、25 μg/ml的样品。精密量取各浓度的芦丁对照品溶液2 ml置于25 ml容量瓶中，加10 ml甲醇，再加1%的三乙胺溶液定容至25 ml，以溶剂为空白，在360 nm处测吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标进行线性回归。线性回归方程为y=0.029x-0.019，相关系数r=0.9989，表明芦丁标准品溶液在浓度为0～25μg/ml范围内浓度与吸光度的线性关系良好。见图2。

图2 芦丁标准曲线图[横坐标为样品浓度（C） 纵坐标为吸光度值（Abs）]

2.4 光明护眼凝胶膏贴剂工艺筛选正交试验及结果

2.4.1 单因素实验提取温度的确定 文献调研得知，乙醇的沸点在75～80℃，随着温度升高总黄酮溶解性增强，所以单次实验提取温度选择为75℃。

2.4.2 单因素实验过程提取时间的选择 用粉碎机将复方粉碎，均分成3份，每份称取1 g左右，在80%的乙醇中75℃温度下回流提取30、60、90 min三个时间，测其黄酮含量，提取时间考察结果总黄酮提取率分别为0.073%、0.116%、0.137%。

2.4.3 单因素实验过程乙醇提取浓度的筛选 将复方粉碎后均分成5份，每份称取1 g左右，分别取50 ml 50%、60%、70%、80%、90% 的三种不同浓度乙醇中，在75℃下回流提取提取40 min。测其黄酮含量。结果总黄酮提取率分别为0.052%、0.068%、0.117%、0.165%、0.143%。

2.4.4 单因素实验过程乙醇提取体积的确定 将复方粉碎，均分成3份，每份称取1 g左右，分别加入 80% 的乙醇 10、15、20 ml，提取结束后，75 ℃下回流提取 30 min。测其黄酮含量。总黄酮提取率分别为0.154%、0.152%、0.156%。

2.4.5 工艺正交筛选试验 正交设计影响光明护眼凝胶膏贴剂总黄酮含量的因素主要有提取次数（A）、加醇量（B）、提取时间（C）、醇浓度（D），故以这四个影响因素的3个水平[4]，采用L9（34）正交表进行实验，以散痛风凝胶膏贴剂中总黄酮的百分含量为评估标准进行考察。各因数水平选取见表1。

表1 因素水平表

2.4.5.1 正交实验结果 由2.4.3分析，以总黄酮提取率为指标的正交试验结果分析，对结果进行统计和方差分析。从2.4.4极差可以看出，各因素对总黄酮类提取率影响的大小顺序为乙醇体积分数（D）＞回流次数（A）＞乙醇用量（B）＞提取时间（D），提取醇浓度80%时总黄酮百分含量最高，为0.169%。正交结果分析可见，最佳优选工艺为A3B1C2D3，即采用80%醇提取法，在提取3次，加醇量为6倍量，提取时间1.0 h。见表2。

表2 正交实验表及结果

2.4.5.2 正交实验的方差分析（表3）

表3 正交实验的方差分析表

3 讨论

通过醇提法的工艺筛选，优选出了光明护眼凝胶膏贴剂总黄酮的较佳提取工艺80%醇提取，提取3次，加醇量为6倍量，提取时间1.0 h。筛选出的工艺操作简单，省时节力，成本较低。采用三乙胺法[5]测定光明护眼凝胶膏贴剂中总黄酮百分的含量[6-20]，控制总黄酮提取的最佳条件，为光明护眼贴凝胶膏贴剂优选出最佳提取工艺参数，合理可靠，简单科学。为光明护眼贴凝胶膏贴剂提供实验和大规模生产依据奠定理论基础。