葛根退赤汤对碱烧伤诱导SD大鼠角膜新生血管的抑制作用

庄家圆 王 方 邓 杰 洪作权

1.贵州中医药大学，贵州贵阳 550001；2.贵州省中西医结合医院眼科，贵州贵阳 550001

角膜新生血管是指在一些特定的条件下，从角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成的一种病理改变，是一种常见的眼部病变[1]。临床上眼部感染性、炎症性及外伤性疾病均可导致角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的形成，如单纯疱疹病毒性角膜炎、翼状胬肉、眼部外伤等[2-3]。新生的毛细血管不仅会导致视力下降，也是角膜移植术后发生免疫排斥反应的高危因素。目前，CNV的确切发生机制仍不清楚，但有研究证实，血中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与CNV形成的各个步骤，是功能最强的促血管生成因子之一[4]，其家族成员VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加[5]。现阶段，角膜新生血管类疾病无特效的治疗手段，部分抗CNV药物仍处于实验研究阶段，且价格昂贵。葛根退赤汤是王方教授根据多年临床经验总结，结合中医基础理论汇聚而成，在临床实践中疗效显著。本研究采用碱烧伤法诱导斯泼累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠CNV模型，观察葛根退赤汤对CNV生长的影响，并对外周血中VEGF-A的表达进行检测，进一步揭示其可能作用机制，以求为中医药治疗角膜新生血管类疾病提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 40只健康成年的SD大鼠，购自湖南省长沙天勤生物技术有限公司，SPF级8～10周龄，重150～220 g，雌雄各半。裂隙灯显微镜下检查排除眼前节病变。

1.1.2 主要试剂及仪器 裂隙灯显微镜（ZEISS Inc，Germany，SL-120），台式高速离心机（德国Epp endorf，5417R），微孔板恒温振荡器（杭州米欧，ST70-2），全 自 动 酶 标 仪（BLOBASE公 司，EL10-A），ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

1.1.3 药物及配制 自拟葛根退赤汤，由葛根30 g、赤芍 10 g、防风 10 g、羌活 10 g、黄连 6 g、法半夏 9 g、密蒙花 12 g、黄芩 10 g、柴胡 10 g、茯苓 12 g、石斛 15 g、皂角刺15 g、苦杏仁12 g、炙甘草6 g组成，此实验用药采用中药新绿色智能颗粒，配方颗粒溶解于超纯水中。

1.2 方法

1.2.1 碱烧伤法诱导SD大鼠CNV模型 正常对照组不做任何处理；其余各组采用100 g/L水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉。将直径3 mm圆形单层滤纸片浸泡在1 mol/L NaOH溶液中，贴敷于大鼠角膜中央40 s，立即用无菌生理盐水充分冲洗结膜囊1 min，回笼后正常环境饲养。以角膜基质层水肿、混浊明显、虹膜隐约可见为造模成功。

1.2.2 分组及治疗 称取体重后，随机分为四组：正常对照组、碱烧伤组、治疗低、高剂量组。除对照组外，于造模后第4天分别给予生理盐水、葛根退赤汤0.69 g/kg及葛根退赤汤1.38 g/kg灌胃，1 d/次，灌胃体积均为10 ml/kg，共14 d。葛根退赤汤，采用中药新绿色智能颗粒剂，成人用量为每天13.2 g，参照熊远珍[6]实验动物与人用药量中成人与动物给药等效剂量换算，得出大鼠与成人等效给药剂量为1.38 g/kg。

1.2.3 角膜炎症反应评分 于第4、8、13天在裂隙灯显微镜观察，采用Ueno等[7]的评分体系，主要包括结膜充血情况、角膜水肿情况及有无眼内渗出或出血。结膜：无充血记0分；角膜缘血管网轻度充血记1分；中度充血记2分；重度充血伴有血管怒张记3分。角膜：无水肿记0分；角膜轻度水肿记1分；角膜中度水肿记2分；角膜重度水肿记3分。眼内渗出或出血：眼内有渗出或出血记1分；无记0分。统计每组角膜炎症反应评分平均值进行比较。

1.2.4 CNV生长情况 第 4、8、13天用裂隙灯显微镜观察SD大鼠CNV生长情况，并用数码相机拍照记录。游标卡尺测量自角膜缘生长出的CNV长度。每次测量时以连续弯曲度最小，朝向角膜中央生长的最长血管的垂直长度为准，使用公式S=C/12×3.14×[r2-（r-l）2][8]计算 CNV 面积。其中S为角膜新生血管面积，C为CNV累计角膜的圆周钟点数，r为角膜半径（SD大鼠角膜平均半径为3 mm），l为CNV从角膜缘长入角膜的长度（mm）。

1.2.5 角膜组织病理学检查 将取下角膜置于4%中性缓冲甲醛固定液中浸泡固定，不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯浸泡透明，石蜡包埋。HE染色：入Harris苏木素液15 min，75%盐酸酒精分化10 s，1%氨水终止分化。入1%伊红己醇液2 min。脱水、透明和封片。Olympus光学显微镜图文分析系统拍照。

1.2.6 ELISA检测VEGF-A 采用股动脉取血法采集大鼠血液，收集于离心管中。所采样本分批4℃恒温离心，3000 r 15 min。取上层血清，立即置于-20 ℃冰箱中低温保存。血清中VEGF-A含量按照ELISA试剂盒检测方法进行。

1.3 统计分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据统计，所有结果均用（）表示。总体均数间比较采用单因素方差分析，各组均数间两两比较采用Bonferroni检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠各时间点角膜碱烧伤炎症指数比较

等同时期内，各组大鼠角膜炎症反应情况的比较：第4、8天，随治疗时间延长，炎症逐渐消退，治疗低、高剂量组与碱烧伤组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同时期内，治疗低、高剂量组，随治疗时间延长，炎症消退。第8天与第4天比较，第13天分别与第4天、第8天比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 四组大鼠各时间点角膜碱烧伤炎症指数比较（±s）

表1 四组大鼠各时间点角膜碱烧伤炎症指数比较（±s）

注：与碱烧伤组同时间点比较，*P＜0.05;与治疗低剂量组同时间点比较，#P＜0.05；“-”为未做

组别 n 第4天 第8天 第13天 F值 P值对照组 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 - -碱烧伤组 10 5.70±0.28 4.60±0.33# 3.20±0.28# 197.917 0.000治疗低剂量组 10 5.40±0.28 3.50±0.28* 2.49±0.18* 337.003 0.000治疗高剂量组 10 5.10±0.28* 3.20±0.28* 2.10±0.28*# 287.917 0.000 F值 11.250 78.750 48.015 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 四组大鼠各时间点CNV面积比较

除对照组外，各组大鼠CNV均于造模后第3～4天由角膜缘开始，逐渐向角膜中心发展，随时间延长呈进行性生长。与碱烧伤组比较，治疗低、高剂量组大鼠CNV生长面积较小，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与高剂量组比较，低剂量组大鼠CNV面积相对较大，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 各组大鼠CNV

表2 各组大鼠各时间点CNV面积比较（±s，mm2）

表2 各组大鼠各时间点CNV面积比较（±s，mm2）

注：与碱烧伤组同时间点比较，*P＜0.05;与治疗低剂量组比较，#P＜0.05；“-”为未做

组别 n 第4天 第8天 第13天 F值 P值对照组 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 - -碱烧伤组 10 12.21±0.79# 20.97±0.82# 23.03±1.34# 316.886 0.000治疗低剂量组 10 11.01±0.49* 14.89±0.98* 18.91±1.53* 130.901 0.000治疗高剂量组 10 9.45±0.47*# 13.62±0.99*# 15.50±1.37*# 92.592 0.000 F值 51.625 176.404 70.382 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 角膜组织病理学改变

角膜组织切片示：对照组角膜透明。碱烧伤组的角膜上皮细胞层及前弹力层均有大量淋巴细胞浸润，基质层排列疏松，可见大量CNV生成。低剂量组CNV数量较碱烧伤组减少，高剂量组大鼠角膜的各层结构完整存在，炎症细胞浸润数量明显减少。见图2。

图2 各组大鼠角膜HE染色像（×400）

2.4 ELISA检测SD大鼠外周血中VEGF-A表达情况

治疗14 d后，检测发现各组的VEGF-A表达值分别为对照组为（3.35±0.11），碱烧伤组为（5.82±0.23），治疗低剂量组为（4.75±0.32），治疗高剂量组为（3.85±0.18）。与碱烧伤组比较，治疗低剂量组和治疗高剂量组的VEGF-A表达均有明显降低（F=224.794，P＜0.01），且治疗高剂量组较低剂量组下降更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

角膜新生血管是病理性的血管组织，其对修复组织损伤有一定的积极作用，但其管腔结构脆弱、功能不全，容易引发再次出血，造成二次角膜水肿及继发的角膜瘢痕化[9-10]，严重影响视力，是目前致盲的主要原因。CNV形成是多因素参与的复杂过程，目前研究较多且公认的机制是促血管生成因子和抑制血管生成因子失衡理论[11]。VEGF在血管发生（从内皮细胞形成新的血管）和血管新生（从已有的血管再形成新的毛细血管）过程中均发挥重要作用，其家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盘生长因子[12-14]。VEGF-A在血管新生中扮演重要角色。对视网膜新生血管形成的研究证实，当血管周围基质微环境中游离VEGF-A浓度升高并且超过一定阈值时，将诱导一部分内皮细胞的极性发生改变[15]。

王方教授根据自己多年来对葛根的研究及临床应用心得，筑方葛根退赤汤。以“清热抑木”为法，以求清热退赤、活血明目之效。《证治准绳·杂病·七窍门》曰：“神水者，由三焦而发源，先天真一之气所化，在目之内……”，故方中重用葛根、赤芍为君，以赤芍清热退赤，葛根生津复神水，以恢复角膜原有的营养供应。另外，现代研究证实，单药葛根中提取的葛根素具有促进侧支循环、抑制缺血再灌注损伤的作用[16]。本研究观察了葛根退赤汤灌胃内服对碱烧伤诱导SD大鼠CNV影响，结果表明治疗低、高剂量组的角膜炎症评分和CNV面积比碱烧伤组明显降低，表明其对CNV有一定的抑制效应。进一步实验证实，在炎症性CNV中，VEGF-A的表达升高，经治疗后VEGF-A显著降低，提示VEGF-A的转录和表达，可能是CNV形成的关键因素，葛根退赤汤通过抑制VEGF-A的表达，从而抑制CNV生成。

实验提示葛根退赤汤在抑制角膜新生血管生成中有潜在的应用价值，且中医药治疗眼部疾病安全可靠、简便廉效，为中医药治疗角膜新生血管提供了一种新的方向。但关于其具体作用机制，仍有待进一步的研究。