基于灰色关联分析研究甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位行气作用谱效关系

2021-03-09 02:42帖晓燕戴海蓉辛国雄张云鹤张文广

中草药 2021年5期

帖晓燕，戴海蓉，辛国雄，张云鹤，张文广，王丹，李芸*

1.甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000

2.平凉市中医医院，甘肃平凉 744000

高乌头为毛莨科乌头属植物高乌头AconitumsinomontanumNakai 的根，又称麻布七、麻布袋、统天袋、穿心莲（四川）、麻布口袋等[1]，在《中华本草》《中药大辞典》等本草著作中均有记载，现收载于2009年版《甘肃省中药材标准》。高乌头为我国中西部地区民间习用中药，是著名的“七药”之一[2]，高乌头疗效良好，却因其毒性而临床使用受限。其辛、苦、温，有毒，具祛风除湿、理气止痛、活血散瘀之功，临床上常用于治疗类风湿性关节炎和局部镇痛，还可用于治疗胃痛、脘腹胀满、急慢性菌痢、急慢性肠炎等。

高乌头含有生物碱、黄酮、甾体、糖苷类等化学成分[3-5]，现代药理研究表明，其具有镇痛、抗炎、局麻、解热、抗肿瘤等广泛作用[6-7]。目前，对高乌头报道最多的是其化学成分研究，包括单体化合物提取、分离、衍生化等，其次是资源开发，包括人工驯化及组织培养等，而有关毒性药效的研究多以高乌甲素单体为主，有效部位的研究较少[8]。目前，其理气作用的研究尚未见报道。

辛可行气，与胃肠运动有一定联系，为进一步全面研究高乌头石油醚部位药效作用，更加科学地诠释该部位药效，本实验从甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位的HPLC 指纹图谱与行气药效的关系入手，采用灰色关联分析[9]对谱效关系进行研究，从而明确其行气药效物质基础，为高乌头的开发与应用提供实验依据和理论支持。

1 材料

10 批不同产地或采收期高乌头药材，经甘肃中医药大学附属医院杨锡仓主任中药师鉴定，为毛茛科乌头属植物高乌头A.sinomontanumNakai 的干燥根，具体编号及来源见表1。

LDZX-30FA 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；BT125D 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；KQ3200DB 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FW-400A 型高建万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；HHS-11S 型数显恒温水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；1100 Series 型高效液相色谱仪，美国Agilent 科技有限公司，含DAD检测器；SHB-3 型循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；Buchi R-200 旋转蒸发仪，瑞士Buchi 实验室仪器公司。

表1 高乌头样品来源信息Table 1 Source information of A.sinomontanum samples

高乌甲素对照品，甘肃神龙药业股份有限公司，批号20001001，质量分数≥98%；冉乌头碱对照品，成都克洛玛生物科技有限公司，批号150404，质量分数≥98%；乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸二氢钠，色谱纯，天津大茂化学试剂厂；石油醚、乙醇，分析纯，天津大茂化学试剂厂；西沙比利胶囊，山东淄博新达制药有限公司，批号180706，规格5 mg。

昆明种小鼠，SPF 级，体质量（20±2）g，雌雄各半，由中国农业科学研究院兰州兽医研究所实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（甘）2015-0001。饲养条件：甘肃中医药大学中药药理实验室，环境温度（23±2）℃，相对湿度50%～60%。动物实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准文号SYXK（甘）2015-0002。

2 方法与结果

2.1 生、制高乌头饮片的制备

高乌头药材净制润软后，切制约为5 mm 的片段，自然干燥，即得高乌头生品饮片。生品饮片用10%的甘草汁（3 mL 含1 g 甘草）润透后，置立式压力蒸汽灭菌器内，温度127 ℃，压力0.5 MPa 条件下蒸制5 h，取出晾干，即得高乌头炮制品饮片[10]。

2.2 生、制高乌头石油醚部位的制备

分别取生、制高乌头饮片，加入10 倍量95%乙醇冷浸24 h 后超声提取，超声（功率300 W、频率40 kHz）45 min，冷浸超声提取2 次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，即得高乌头醇提物。所得稠膏继续加水制成混悬液，用石油醚萃取4 次，每次200 mL，35 ℃以下减压回收石油醚，即得生、制高乌头石油醚部位[11-12]。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液制备分别取“2.2”项生、制高乌头石油醚部位浸膏0.5 g，精密称定，加甲醇溶解，定容至10 mL，密塞，摇匀，进样前用0.45 μm 微孔膜滤过，即得。

2.3.2 对照品溶液制备分别精密称定高乌甲素、冉乌头碱对照品8.01、2.96 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度线，即得高乌甲素与冉乌头碱混合对照品溶液（含高乌甲素0.801 mg/mL、冉乌头碱0.296 mg/mL）。

2.4 色谱条件

采用Dikma spursil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.05 mol/L 磷酸二氢钠水溶液-乙腈，梯度洗脱，洗脱条件见表2，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测波长235、254、280、290、308 nm[13-14]。

表2 HPLC 洗脱程序Table 2 Gradient procedures of HPLC

2.5 HPLC-DAD 指纹图谱的建立

2.5.1 精密度试验取适量高乌头石油醚部位浸膏（S1），按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样分析，连续进样6 次，将所得色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，得到各图谱的相似度均大于0.96，计算45 个主要共有峰相对保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，表明此方法精密度较好。

2.5.2 稳定性试验取适量高乌头石油醚部位浸膏（S1），按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h，按“2.4”项下色谱条件进行测定，将所得色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，得到各图谱的相似度均大于0.94，计算45 个主要共有峰相对保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.5.3 重复性试验取适量高乌头石油醚部位浸膏（S1），按“2.3.1”项下方法平行制得6 份供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，将所得色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，得到各图谱的相似度均大于0.90，计算45 个主要共有峰相对保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，表明该方法重复性较好。

2.5.4 生、制高乌头石油醚部位HPLC-DAD 指纹图谱建立取“2.2”项下制备的10 个不同批次高乌头石油醚部位，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样分析，每个样品选取235、254、280、290、380 nm 5 个色谱峰信息相对丰富的波长作为匹配基准，将不同波长检测到的同一成分进行匹配，若该成分不出峰则峰积分计0[15-16]，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，以S1、Z1 样品为参照图谱，采用中位数矢量法进行多点校正生成生、制高乌头石油醚部位多波长融合HPLC-DAD 指纹图谱（MWFF），并生成对照指纹图谱（R），再对其进行相似度评价。在0～110 min 内，以稳定性和重复性好、特征明显的色谱峰作为共有峰。5 个不同波长下10 批生、制高乌头石油醚部位的HPLC 图谱、MWFF 指纹图谱共有模式及对照指纹图谱分别见图1～3，生、制高乌头石油醚部位的共有峰峰面积见表3、4。每批生、制高乌头石油醚部位样品非共有峰总面积占总峰面积的比值均＜10%，符合指纹图谱要求。

图1 10 批 (S1～S10) 生高乌头石油醚部位的HPLC 多波长指纹图谱Fig.1 MWFF of petroleum ether fraction of 10 batches of raw A.sinomontanum (S1—S10)

图2 10 批 (Z1～Z10) 制高乌头石油醚部位的HPLC 多波长指纹图谱Fig.2 MWFF of petroleum ether fraction of 10 batches of processed A.sinomontanum (Z1—Z10)

2.6 高乌头石油醚部位行气作用的影响

取昆明种小鼠224 只，雌雄各半，按随机数字表随机各分为16 组，每组14 只，雌雄各7 只，即对照组（0.5%甲基纤维素）、阳性组（西沙比利0.1 mg/kg），S1～S7、Z1～Z7 组，分别称取S1～S7、Z1～Z7 组的高乌头石油醚部位于量瓶中，加入0.5%甲基纤维素制成混悬液进行使用，配制成3.04 mg/mL 的生品高乌头石油醚部位混悬液及4.39 mg/mL 的制品高乌头石油醚部位混悬液，各组小鼠按20 mL/kg 进行ig 给药，1 次/d，连续给药7 d，于末次给药前禁食12 h，给药后30 min，每只小鼠ig 给予新鲜配制的炭末混悬液（活性炭和阿拉伯树胶各含10%）0.4 mL，20 min 后脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管。轻轻将小肠拉成直线，测量小肠全长与从幽门至炭末前沿的距离，计算小肠推进率，结果见表5。

小肠推进率＝炭末推进长度/小肠长度

2.7 生、制高乌头石油醚部位HPLC 图谱与行气作用的灰色关联分析

图3 生、制高乌头石油醚部位多波长HPLC 对照指纹图谱Fig.3 Control fingerprint of petroleum ether fractions of raw and processed A.sinomontanum

2.7.1 原始数据的无量纲化处理原始数据的变换采用均值化变换法。变换的母序列记为{Y0(k)}，子序列记为{Yi(k)}。将生、制高乌头石油醚部位行气作用的药效指标作为母序列，生、制高乌头石油醚部位的共有峰峰面积作为子序列。

2.7.2 绝对差序列及关联系数的计算在t＝k时（k为不同产地批次编号），母序列记为{Y0(k)}，子序列记为{Yi(k)}，母序列与子序列的绝对差序列δ0i(k)＝|Y0(k)－Yi(k)|（1≤i≤m）。计算在t＝k时母序列与子序列的关联系数η(k)。

2.7.3 关联度（r）的计算r实质上是对时间序列几何关系的比较，是母序列与子序列各个时刻的关联系数的平均值，结果见表6、7。

m为子序列的数据个数

由表6、7 中7 批不同产地生、制高乌头石油醚部位共有峰与其行气作用的关联分析数据可知，生品高乌头石油醚部位各成分对行气作用药效贡献度较大的共有峰（峰号）主要有峰40＞7＞30＞14＞36＞24＞13＞15＞33＞23＞41＞43＞9＞21＞28＞31＞37＞17＞34＞1＞20＞35＞6＞45＞3＞44＞26＞29＞11＞10＞25＞18＞2＞8＞12＞5，其中峰40、7、30、14、36、24、13、15、33、23、41、43、9、21、28、31、37、17、34 的关联度均大于0.8，初步确定这19 个峰作为行气作用的主要成分；制品高乌头石油醚部位各成分对行气作用药效贡献度较大的共有峰（峰号）主要有峰41＞29＞4＞27＞30＞33＞34＞20＞1＞45＞22＞19＞38＞31＞18＞14＞28＞35＞42＞17＞16＞32＞11＞43＞39＞10；其中峰41、29、4、27、30、33、34、20、1、45、22、19、38、31、18、14、28 的关联度均大于0.8，初步确定这17 个峰作为行气作用的主要成分，说明甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位的行气作用是“化学成分群”共同作用的结果，经过与对照品和文献信息进行指认后，确定10 号峰为高乌甲素，11 号峰为冉乌头碱。

表3 生品高乌头石油醚部位指纹图谱共有峰峰面积Table 3 Common peak area of fingerprint of petroleum ether fractions of raw A.sinomontanum

表4 制品高乌头石油醚部位指纹图谱共有峰峰面积Table 4 Common peak area of fingerprint of petroleum ether fractions of processed A.sinomontanum

表5 生、制高乌头石油醚部位对正常小鼠肠推进的影响(±s,n=14)Table 5 Effects of raw and processed A.sinomontanum petroleum ether fraction on small bowel movement in normal mice (±s,n=14)

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs control group

组别推进率/% 组别推进率/%对照组 57.18±10.23 S4 64.43±5.65*阳性组 70.33±5.94** Z4 63.94±7.33*S1 60.91±9.55 S5 61.89±6.60 Z1 62.03±6.28 Z5 61.23±9.36 S2 63.14±7.94 S6 64.73±8.17*Z2 66.79±6.32** Z6 64.15±7.06*S3 68.54±7.44** S7 61.81±10.34 Z3 64.89±8.13* Z7 64.80±8.80*

表6 生高乌头石油醚部位关联序结果Table 6 Results of correlation sequence of petroleum ether fraction of raw A.sinomontanum

表7 制高乌头石油醚部位关联序结果Table 7 Results of correlation sequence

3 讨论

本研究对甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位HPLC 指纹图谱特征与其行气作用量化数据的基础上，采用灰度关联分析技术，确定了指纹图谱特征峰所代表的的化学成分对行气作用贡献的大小。以235、254、280、290、308 nm 5 个最丰富的色谱峰为分析对象，通过对高乌头生品及制品石油醚部位指纹图谱色谱峰的归属和比较，发现炮制后高乌头石油醚部位多波长融合HPLC-DAD 指纹图谱整体图貌、色谱峰检出数目及各色谱峰峰面积的变化均比较明显，具体表现为（1）高乌甲素与冉乌头碱的比例由2∶1 变成1∶2；（2）比较高乌头生、制品石油醚部位的特征色谱峰的检出数量发现，制品石油醚部位新增了8 个色谱峰，消失了18 个峰，其色谱峰检出数目的多少反映了样品炮制前后化学成分种类的增减情况；（3）各色谱峰峰面积的变化反映了该化学成分量的变化。由图3、表5可知，甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位指纹图谱发生了显著改变，高乌头石油醚部位经甘草汁蒸制后仍然具有行气功效；由表6、7 数据可知，生品高乌头石油醚部位40、7、30 号峰及制品高乌头石油醚部位41、29、4 号峰所代表的化学成分对行气作用贡献显著（关联度＞0.9）。

毒性中药的炮制应该从减毒和存效2 个方面着手。甘草汁作为一种常用的炮制辅料，其解毒作用早在《神农本草经》中就有记载，历代炮制有毒药物如半夏、川乌等都用甘草解毒。在以往的乌头类中药配伍组方中以甘草和肉桂为多，减毒机制可能为促进肝药酶代谢或形成难溶性络合物[17-18]。现代药理学研究表明，甘草甜素、甘草次酸等成分是甘草减毒的物质基础，其具有在体内或体外与毒物发生化学反应、肾上腺皮质激素样作用、多种药理活性对抗中毒症状、调节肝脏细胞色素P450 酶系代谢以及诱导P-糖蛋白表达等多种解毒机制[19-25]，但其解毒机制有待深入研究。乌头类药材中含有大量的双酯型生物碱，受热的状况下容易水解，使其毒性降低。高乌头经甘草汁蒸制后毒性、药效发生变化，其根源是内在物质基础发生了改变，炮制后消失的成分和含量降低的成分是高乌头表现出“减毒”的物质基础，炮制后产生大量新的物质及含量增高的成分，很可能是高乌头“存效”的物质基础。

高乌头含有生物碱，其石油醚部位多含挥发油，推测挥发油和生物碱类成分可能是高乌头“辛”味物质基础。因此，本研究基于石油醚部位所含化学成分的特殊性，从对胃肠运动的作用角度切入，首次以炭末推进实验探索了高乌头行气的功效，进一步全面诠释高乌头药效。该研究表明高乌头石油醚部位经甘草汁蒸制后仍然具有行气功效，这一结果与中药炮制存效的目的相符合。而不同产地高乌头石油醚部位药效研究比较，发现其行气作用存在差异，这与中药的药效受区域性影响较大的观点相一致[26-27]。

生品高乌头石油醚部位40、7、30 号峰及制品高乌头石油醚部位41、29、4 号峰，对高乌头的药效具有较大的影响，介于目前没有对照品，下一步可通过质谱等手段进一步分析检测并鉴定成分，为明确药效成分提供理论基础。此外，甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位的行气作用可能是多成分共同作用的结果，提示下一步的工作重点将是对这6种药效成分进行定量分析以及药效评价等研究，以期可以进一步明确甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位行气作用的谱效关系，为科学阐明高乌头行气作用的药效物质基础提供新思路。

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