干漆及大黄䗪虫丸中非法染色成分808 猩红的检测

钟水生，张华锋，王亚琼，孙秀华，周 坚

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州 215000）

干漆，异名漆渣，是漆树科植物漆树Toxicodendron vernicifluum（Stokes）F.A.Barkl.的树脂生漆经加工后的干燥品，有破瘀通经、消积杀虫的功效，主要用于瘀血闭经癥瘕积聚虫积腹痛等病症［1-2］。大黄䗪虫丸为干漆与其他药材如熟大黄、土鳖虫、水蛭等11 味组方制成的中药制剂，具有活血破瘀、通经消癥的功效，主要用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经，症见腹部肿块、肌肤甲错等病症［1］，现代临床也有将其用于心绞痛、乙型肝炎纤维化和慢性前列腺炎等的治疗［3-8］。

对收集到的大黄䗪虫丸进行按国家药品标准检验时发现，部分厂家的大黄䗪虫丸样品的薄层鉴别试验中呈现出未知红色斑点。经查阅相关文献，并刮取该未知红色斑点进行筛查，结果疑似为808 猩红。808 猩红，为偶氮类红色化工染料，常用于涂料、油墨、油漆、皮革等化工产品的着色，它并非食用色素，其在机体内经生物转化分解，可形成致癌物，具有致癌和致突变等毒性，严重影响患者的安全与健康［9-10］。

目前尚未有干漆及干漆制剂中染色成分研究的报道。为进一步确证并探索808 猩红的来源，本课题组参考808 猩红测定的相关报道［11-16］，建立了干漆及大黄䗪虫丸中808 猩红的检测方法，以期为干漆及干漆制剂的质量控制乃至安全用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695-2998 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；岛津LC-20AD-8050 液质联用仪（日本岛津公司）；梅特勒XS205DC 分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 试剂与药物 808 猩红（中国食品药品检定研究院，批号111940-201804）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，甲酸为色谱纯，乙酸铵为分析纯。大黄䗪虫丸为全国药品评价性抽验样品，干漆（煅）饮片为部分大黄䗪虫丸生产企业提供的留样，并经苏州市药品检验检测研究中心张华锋副主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 对照试剂溶液制备 精密称取808 猩红对照试剂适量，加甲醇溶解，制成每1 mL 含5 μg 的溶液，作为对照试剂溶液。供HPLC 测定的对照试剂溶液，以流动相250 倍稀释后可用于HPLC-MS／MS进行确证分析。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 干漆供试品溶液制备 取干漆（煅）适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷25 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，容器及滤渣用三氯甲烷50 mL 分次洗涤，合并滤液，蒸干，残渣用甲醇适量溶解，并转移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.2 大黄䗪虫丸供试品溶液制备 取大黄䗪虫丸水蜜丸或水丸适量，研细，取约3 g，精密称定；或取大蜜丸适量，剪碎，取约6 g，精密称定，精密加入硅藻土3 g，研匀，取约4.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷25 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，容器及滤渣用三氯甲烷50 mL分次洗涤，合并滤液，蒸干，残渣用甲醇适量溶解，并转移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

以上供HPLC 测定的供试品溶液，以流动相50 倍稀释后可用于HPLC-MS／MS 进行确证分析。

2.3 液相色谱-UV 条件 Boston C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1% 甲酸；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；进样量50 μL；检测波长518 nm。

2.4 专属性试验 精密吸取对照试剂溶液、干漆供试品溶液与大黄䗪虫丸供试品溶液各50 μL，注入液相色谱仪测定，结果阳性样品出现与对照试剂溶液相同保留时间的色谱峰，而阴性样品无相应的色谱峰，见图1。阳性样品中与808 猩红对照试剂溶液保留时间一致的色谱峰的吸收光谱与808 猩红对照试剂溶液一致。

图1 干漆及大黄䗪虫丸HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of dried lacquer and Dahuang Zhechong Pills

2.5 液相色谱-质谱确证试验

2.5.1 色谱条件 Waters HSS C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸（80 ∶20）；体积流量0.3 mL／min；柱温35 ℃；进样量2 μL。

2.5.2 质谱条件 接口电压3.0 kV；接口温度300 ℃；DL 温度 250 ℃；雾化气体积流量3 L／min；干燥器体积流量10 L／min；加热气体积流量10 L／min；离子化模式ESI+；模式多反应监测（MRM），选择m／z 368.20～275.05 和m／z 368.20～219.10 作为检测离子对，碰撞电压分别为-17、-34 eV。

精密吸取供HPLC-MS／MS 确证的对照试剂溶液与阳性供试品溶液各2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪测定，结果干漆和大黄䗪虫丸阳性样品的m／z 368.20～275.05 和m／z 368.20～219.10 离子流色谱图中，均出现与对照试剂色谱保留时间相同的色谱峰，且色谱峰质谱中，两监测离子对的丰度比与对照试剂基本一致。见图2。

图2 各样品MRM 图Fig.2 MRM chromatograms of various samples

2.6 线性关系考察 精密称取808 猩红对照试剂6.66 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得对照试剂溶液Ⅰ。精密吸取对照试剂溶液Ⅰ适量，加甲醇依次制成质量浓度为6.66 μg／mL（对照试剂溶液Ⅱ）和0.666 μg／mL的对照试剂溶液（对照试剂溶液Ⅲ）。分别精密吸取对照试剂溶液Ⅰ50 μL；对照试剂溶液Ⅱ10、20、50 μL；对照试剂溶液Ⅲ10、20、50 μL，在“2.3”项条件下进样，以对照试剂进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程为Y＝2.867×106X+3.040×103（r ＝1.000），表明808 猩红在0.033 3～3.33 μg 范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 精密吸取上述808 猩红对照试剂溶液Ⅱ50 μL，在“2.3”项条件下连续进样6次，测得808 猩红峰面积RSD 为0.1%。表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

2.8.1 干漆 取同一批号的干漆阳性样品（D 厂，批号170602）0.5 g，共6 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样，计算含量。测得808 猩红的平均含量为254.5 μg／g，RSD 为1.6%。表明该方法重复性良好。

2.8.2 大黄䗪虫丸 取同一批号的大黄䗪虫丸阳性样品（水蜜丸，B 厂，批号180702）适量，研细，取3.0 g，共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样，计算含量。测得808 猩红的平均含量为37.3 μg／g，RSD为0.9%。表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

2.9.1 干漆 取同一批号的干漆阳性样品0.5 g，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样，测得峰面积RSD 为0.9%，表明供试品溶液中808 猩红在12 h 内稳定性良好。

2.9.2 大黄䗪虫丸 取同一批号的大黄䗪虫丸阳性样品适量，研细，取3.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样，测得峰面积RSD为1.2%，表明供试品溶液中808 猩红在12 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

2.10.1 干漆 精密称取已知808 猩红含量的干漆阳性样品（D 厂，批号170602，含量254.5 μg／g）粉末0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入对照试剂溶液Ⅰ1 mL，挥干甲醇，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.3”项条件下进样，计算加样回收率，测得808 猩红平均加样回收率为100.2%，RSD 为1.2%。见表1。

表1 干漆加样回收率试验结果（n＝6）Tab.1 Results of recovery tests for dried lacquer（n＝6）

2.10.2 大黄䗪虫丸 精密称取已知808 猩红含量的大黄䗪虫丸阳性样品（水蜜丸，B 厂，批号180702，含量37.3 μg／g）粉末1.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入对照试剂溶液Ⅰ1 mL，挥干甲醇，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.3”项条件下进样，计算加样回收率，测得808猩红平均加样回收率为99.8%，RSD 为1.8%。见表2。

表2 大黄䗪虫丸加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for Dahuang Zhechong Pills（n＝6）

2.11 检测限 将808 猩红对照试剂溶液稀释，在“2.3”项条件下进样，以信噪比（S／N）在3 左右所对应的质量浓度作为检测限。测得808 猩红的检出限为1.67 ng。

2.12 样品检测 取不同厂家不同批次干漆样品6批（涉及生产企业6 家）和大黄䗪虫丸样品93 批（涉及生产企业13 家），按“2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取对照试剂溶液与供试品溶液各50 μL，在“2.3”项条件下进样测定；阳性样品再以液相色谱-质谱联用法进行进一步确证。结果D 厂提供的1 批干漆饮片（批号170602）检出808 猩红，含量为254.5 μg／g；16 批大黄䗪虫丸中检出808 猩红，涉及生产企业4 家，结果见表3。

表3 大黄䗪虫丸中808 猩红含量检出结果（μg／g）Tab.3 Results of content determination of 808 scarlet in Dahuang Zhechong Pills（μg／g）

3 讨论

大黄䗪虫丸中组方药味较多，成分也复杂，且其中干漆的比例仅有1.2%～2.3%，简单的超声处理的方法难以有效地检测到其中的808 猩红。因此尝试采用萃取浓缩的方式进行处理。比较了乙醇超声处理后浓缩、三氯甲烷超声处理后浓缩的方式，发现经乙醇超声处理后浓缩的样品黏度较大，不利于808 猩红的复溶，而三氯甲烷超声处理能较好的避免这个问题，且具有较好的提取效率，故最终选用三氯甲烷作为提取溶剂。

本研究收集到的93 批大黄䗪虫丸中有16 批样品检出808 猩红，涉及4 个生产厂家。对收集的大黄䗪虫丸投料所用药味进行染色剂808 猩红快速筛查，发现1 家大黄䗪虫丸阳性样品生产企业提供的干漆样品中疑似检出808 猩红，且该干漆样品在视野下呈现有红色粉末及块状物，后期采用建立的干漆中808 猩红的液相和液质检测方法进行进一步检测，证实确为检出808 猩红，因此成药中的染色剂808 猩红最有可能是干漆带入。

查阅相关文献，干漆为生漆中的漆酚在漆酶的作用下，在空气中氧化生成的黑色树脂状物［17］，然而现代社会为了满足涂装修饰的要求，人们会在生漆的加工过程中加入各种添加剂，如分散剂、颜料等［18］。由于2020 年版《中国药典》 对干漆来源的描述较为宽泛，加上尚未有相关的检测方法来检测其中的添加剂，导致部分不法商家为追逐利益而混入含有添加剂的“漆渣”，进而使干漆及含干漆制剂大黄䗪虫丸中非法染色成分808 猩红的检出。

然干漆和大黄䗪虫丸样品808 猩红的检出仅集中在部分厂家的部分批次当中，并非同一厂家的每一批都检出808 猩红，表明饮片企业或中成药生产企业在采购干漆时，未进行该方面的检查，且含808 猩红的药材已进入中成药生产企业，并对中成药的药用安全造成了严重影响。这提示，一方面，饮片企业、中成药生产企业及其他干漆使用单位在药材或饮片的采购中，应严把药材来源，除按常规的标准检验外，还应进行染色剂检查，管控药材质量；另一方面，药品监管部门在日常工作中，应加强规范干漆药材及饮片的市场管理，重视干漆采制加工环节的监管，并逐步将808 猩红的检查方法纳入干漆及含干漆制剂的常规检验中。

本实验建立的808 猩红检测方法，操作简单，重现性好，能满足实验需求，且课题组首次在干漆及干漆制剂中检出非法染色成分808 猩红，多批大黄䗪虫丸和干漆中808 猩红的检出提示着干漆和大黄䗪虫丸，乃至其他含干漆制剂（包括平消片、脑塞通丸等）的临床使用可能存在着较大的安全隐患，需要进行严格的监管。