GC-ECD法测定茵栀黄口服液（注射液）中23种有机氯和菊酯类农药残留

王娟，李媛，王云霞，谢志民（西安市食品药品检验所，西安 710054）

茵栀黄口服液（注射液）是2019年国家评价性抽检品种。茵栀黄注射液为原上海和黄药业有限公司根据中医名方“茵陈蒿汤”研制而成，茵栀黄口服液为原北京第四制药厂由茵栀黄注射液改变剂型而来。目前，茵栀黄注射液全国有6 家生产企业拥有10 个批准文号，目前只有神威药业有限公司少量生产；茵栀黄口服液全国只有北京华润高科天然药物有限公司拥有1 个批准文号（国药准字Z11020607）。处方由茵陈提取物、栀子提取物、黄芩提取物、金银花提取物组成，具有清热解毒、利湿退黄的功效。临床上茵栀黄口服液用于治疗新生儿黄疸[1-2]、妊娠期肝内胆汁淤积症[3]、肝硬化黄疸[4]、青少年胆心综合征[5]等。茵栀黄注射液屡次报告不良反应和事件[6-7]，国家药品监管总局在2016年8月23日发布了“总局关于修订茵栀黄注射液说明书的公告（2016年第140 号）”，公告附件中说明书【禁忌】项包括“2.新生儿、婴幼儿禁用；3.孕妇禁用”。

近年来，农药在中药材种植中广泛使用，中成药的农药残留问题已引起关注，本品口服液经常用于新生儿黄疸的治疗，监测农药残留量尤为重要。有机氯农药如使用最早、应用最广的杀虫剂二二三（DDT）和六六六（BHC），BHC 虽已禁用多年，但不易降解，土壤中残留明显[8]，DDT 仍在使用，菊酯类农药则广泛使用。金银花在种植过程中病虫害频繁且严重，农药防治是主要手段，农药残留污染比较严重，检出率较高[9-11]，有机氯和菊酯类农药均有检出。栀子中有检出有机氯[12]，黄芩中有检出BHC 和DDT[13]，茵陈尚未见报道，原药材中可能有农药残留，所以有必要监测制剂的农药残留量。笔者用GC-ECD 法测定茵栀黄口服液（注射液）中23 种有机氯和拟除虫菊酯类农药残留，以期为茵栀黄口服液（注射液）安全性评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 7890A 型气相色谱仪、63NI-ECD 电子捕获检测器、HP-5 毛细管柱：（5%苯基）甲基聚硅氧烷柱（柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚度0.25 μm）（美国安捷伦公司）；RE 52-99 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

17 种有机氯农药混合对照品溶液（批号：610005-201802，中国食品药品检定研究院，含六氯苯2.03 mg·L－1、α-六六六 1.98 mg·L－1、五氯硝基苯2.02 mg·L－1、γ-六六六 2.08 mg·L－1、七 氯1.97 mg·L－1、艾氏剂1.93 mg·L－1、β-六六六 1.49 mg·L－1、氧化氯丹2.09 mg·L－1、δ-六六六 1.99 mg·L－1、顺式环氧七氯2.06 mg·L－1、反式环氧七氯1.95 mg·L－1、反式氯丹2.01 mg·L－1、顺式氯丹2.04 mg·L－1、p，p'-滴滴伊2.04 mg·L－1、o，p'-滴滴涕2.06 mg·L－1、p，p'-滴滴滴2.05 mg·L－1、p，p'-滴滴涕20.8 mg·L－1）；对照品溶液百菌清[批号：GBW（E）081500-M351]、三唑酮[批号：GBW（E）081507-5252]、联苯菊酯[批号：GBW（E）081474-53Μ1]、氯氰菊酯[批号：GBW（E）0811476-2BV2]、氰戊菊酯[批号：GBW（E）081471-J392]、溴氰菊酯[批号：GBW（E）081468-M351]（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司，浓度均为100 mg·L－1）；氯氟氰菊酯对照品（批号：SB05-42292018，农业部环境保护科研检测所，浓度为100 mg·L－1）。

正己烷、丙酮均为农残级；氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯。

1.3 样品

样品均为国家评价性抽检样品，38 批次样品来自于16 个省级行政区域，来自于药品经营单位的有25 批次，来自于药品使用单位的有13 批次，其中注射液6批（神威药业集团有限公司）、口服液32批（北京华润高科天然药物有限公司）（批号分别为272388、272508、272538、272588、272608、272668、272678、272728、272738、272748、272788、272848、272858、272898、2721247、2721277、2721437、181001、181102、181107、181108、181110、181112、181113、181116、181209、181216、181217，其中口服液中有4 批批号重复）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密量取百菌清对照品溶液、三唑酮对照品溶液、联苯菊酯对照品溶液、氯氟氰菊酯对照品溶液、氯氰菊酯对照品溶液、氰戊菊酯对照品溶液、溴氰菊酯对照品溶液各0.2 mL，置同一50 mL 量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为菊酯对照品储备液。精密量取17 种有机氯农药混合对照品液2 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入上述菊酯对照品储备溶液2 mL，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液；精密量取3 mL，置5 mL 量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取茵栀黄口服液5 mL（注射液10 mL），加入丙酮-水（7∶3）的混合溶液15 mL（注射液30 mL），加入5%氯化钠溶液10 mL（注射液20 mL），振摇 1 min，置分液漏斗中，用正己烷振摇提取3 次，每次10 mL （注射液20 mL），合并提取液，置装有10 g 无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，振摇，放置30 min。滤过，用少量正己烷洗涤残渣及滤纸，与上述滤液合并，于40℃减压浓缩至近干，用正己烷2 mL 分3 次溶解并转移至佛罗里硅土固相萃取小柱[（博纳艾杰尔），用正己烷-丙酮（9∶1）混合溶液10 mL 和正己烷10 mL 预洗]上，用正己烷-丙酮（9∶1）混合溶液10 mL 洗脱，收集上样液和洗脱液，40℃减压浓缩至干，加少量正己烷反复3 次操作至丙酮除尽，加正己烷使溶解，定量转移至5 mL 量瓶中，摇匀，用0.45 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3 色谱条件

采用（5%苯基）甲基聚硅氧烷毛细管柱，63NIECD 电子捕获检测器，进样口温度250℃，检测器温度330℃，不分流进样。程序升温：初始60℃，保持1 min；以90℃·min－1速率升至150℃，保持5 min；以1℃·min－1速率升至160℃，保持10 min；以2℃·min－1速率升至220℃；以10℃·min－1速率升至280℃，保持6 min；以10℃·min－1速率升至290℃，保持10 min。载气高纯氮，99.999%，流速60 mL·min－1，进样量1 μL。

2.4 系统适用性试验

取阴性茵栀黄口服液（批号：181206，经检测未含有机氯和农药残留的样品），按照“2.2”项下方法制备阴性样品溶液。精密量取“2.1”项下混合对照品溶液 2 mL，置具塞锥形瓶中，氮气吹干，精密加入茵栀黄口服液 （批号：181206）5 mL。按照“2.2”项下方法制备加标供试品溶液。分别精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液及上述阴性样品溶液及加标供试品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件进样。在该色谱条件下，各色谱峰分离良好，峰形对称，阴性样品对测定无干扰，结果见图1。

图1 茵栀黄口服液（注射液）气相色谱图Fig 1 Gas chromatogram of Yinzhihuang oral liquid （injection）

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密量取17 种有机氯农药混合对照品溶液2 mL，置5 mL 量瓶中，精密加入“2.1”项下菊酯对照品储备溶液2 mL，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液，逐级稀释制成不同浓度的系列混合对照品溶液。分别精密吸取系列混合对照品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，以对照品溶液（μg·L－1）为横坐标、峰面积为纵坐标，计算得回归方程，相关系数均＞0.999。说明在该系统条件下，各组分在对应浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

2.5.2 仪器精密度考察 精密吸取“2.5.1”项下高、中、低质量浓度对照品溶液各1 μL，每份进样6 次，计算变异系数。结果除o，p'-滴滴涕RSD为2.1%、氯氰菊酯RSD为2.5%外，其余21种农药的RSD均小于2.0%。

2.5.3 重复性试验 精密量取“2.1”项下混合对照品储备液3 mL 共6 份，置具塞锥形瓶中，氮气吹干，精密加入茵栀黄口服液（批号：181206）5 mL，按“2.2”项下方法制备样品溶液，取“2.1”项下对照品溶液和样品溶液各1 μL，按“2.3”项下色谱条件测定（n＝3）。按外标一点法计算含量RSD，结果均小于1.2%。

2.5.4 稳定性试验 分别于0、2、4、8、12、16、20 和24 h 精密吸取重复性考察项同一供试品溶液1 μL，按“2.3”项下色谱条件测定，计算变异系数，结果23 种农药峰面积的RSD均小于5%，表明供试品溶液中23 种农药在24 h 内均稳定。

2.5.5 加样回收试验 取“2.5.3”项下供试品溶液6份，分别加入含百菌清、三唑酮和5 种菊酯浓度32 μg·L－1、其余17 种有机氯浓度160 μg·L－1的混合对照品溶液3 mL，按“2.3”项下色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果23 种农药的回收率为81.68%～116.2%（见表2）。

2.5.6 检测限和定量限

① 加样对照品溶液的制备：精密量取各对照品溶液制成含百菌清、三唑酮、5 种菊酯质量浓度为6 μg·L－1，17 种有机氯质量浓度为20 μg·L－1的溶液作为1 号混合对照品溶液；稀释制成百菌清、三唑酮、5 种菊酯质量浓度1.8 μg·L－1、17 种有机氯质量浓度6 μg·L－1的溶液作为2 号混合对照品溶液。

② 检测限和定量限的测定：精密量取上述1号混合对照品溶液0.7 mL、1.3 mL，2 号混合对照品溶液0.7 mL、1.3 mL，置具塞锥形瓶中，氮气吹干，分别精密加入茵栀黄口服液（批号：181110）样品5 mL，共4 份，按照“2.2”项下样品制备方法，制备供试品溶液。按“2.3”项下条件测定，以基线噪音3 倍量峰高时的含量为检测限、10 倍量峰高时的含量为定量限，结果见表2。

表1 有机氯和拟除虫菊酯类的回归方程Tab 1 Regression equation of organochlorine and pyrethroid pesticides

表2 有机氯和拟除虫菊酯类的添加回收试验、检测限及定量限Tab 2 Recovery，limit of detection and limit of quantitative of organochlorine and pyrethroid pesticides

2.6 样品的含量测定

对28 批口服液、6 批注射液进行测定，均未检出农药残留。结果均符合按新生儿（体质量5 kg）一日最大服用量计算的限度。

3 讨论

3.1 11 号色谱峰的说明

色谱图中11 号峰为环氧七氯，是顺式环氧七氯和反式环氧七氯的混合物。

3.2 样品提取、净化方法的选择

笔者比较了浓硫酸净化和固相萃取柱（Florisil）净化两种方法，结果菊酯类农药在浓硫酸净化中几乎零回收，故选用固相萃取柱净化法[14-16]。茵栀黄口服液制法中每1000 mL 含有蔗糖100 g、蜂蜜50 g[17]，属于高糖样品，在提取过程中应去除糖类物质的干扰。丙酮水溶液的盐析作用可除去糖类等水溶性的杂质，用于含多糖类样品中农药的提取。