降脂轻身方对高脂血症小鼠调节作用的分子机制

徐变玲王 楠张 理徐学功

（1.郑州市中医院，河南郑州 450007；2.河南中医药大学，河南郑州 450046）

高脂血症是指血清中胆固醇和（或）甘油三酯水平升高，是一种发病隐匿的内分泌疾病［1］。直至2015 年，我国成人患有高脂血症人群占总人口40.4%，并且呈现逐年增高的趋势［2］。祖国医学认为高脂血症属于本虚标实之证。本虚是指脏腑功能虚衰，以脾胃气虚肝肾阴虚为主；标实是指痰瘀交阻而内留，以痰浊、血瘀为主［3］。降脂轻身方由苍术、白术、茯苓、半夏、大黄、番泻叶、牵牛子、薏苡仁、泽泻、大腹皮、木香、枳实、陈皮、丹参、生山楂等组成。该方配伍严谨，治疗血脂异常临床疗效确切［4］。

长链非编码RNA（lncRNA）是指一类转录本长度大于200 个核苷酸单位，不编码蛋白质的非编码RNA［5］。lncRNA 在不同生物过程中发挥重要作用，参与了表观遗传、转录和转录后调控过程，并与人类的重大疾病密切相关［6］。有研究报道，lncRNA 在心血管疾病的发生与发展中起到了关键的作用［7］。

本实验通过降脂轻身方对高脂血症小鼠的降脂作用为研究对象，以mRNA 和lncRNA 的的表达芯片为研究手段，分析降脂轻身方的作用靶点及代谢通路，来探究其改善高血脂的机制，为临床治疗高脂血症提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 分组与给药 采用SPF 级C57BL／6 背景6 周龄健康雄性野生型小鼠和ApoE-／-健康雄性小鼠为研究对象，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0011。适应环境1 周后，以11 只C57BL／6 小鼠为正常对照组，给予普通饮食（玉米24.5%，麸皮24.5%，大麦21%，豆饼12%，鱼粉6%，其他辅料12%，不包含胆固醇或动物油等任何高脂成分）；ApoE-／-小鼠随机分为（1）模型组，给予普通饮食；（2）给药组，在普通饮食中加入降脂轻身方（按照成人20 粒／d 进行换算，每只1.365 g／kg，每组11 只。所有小鼠均饲养于恒温（22 ℃）恒湿（60%）环境中，12 h 明暗交替，自由摄食、饮水，饲养16 周。小鼠禁食过夜，次日称量体质量并记录，眼球取血后处死，血液于室温静置分层后，3 500 r／min离心5 min 吸取上层血清进行检测，手术剪打开胸腔，剪断下腔静脉，用镊子捏住边缘系膜，完整剪下整个肝脏，放入10 cm培养皿中，取肝脏中叶组织送公司测序，剩余组织保存于液氮用于后续实验。动物实验均于河南中医药大学动物实验中心完成。

1.2 试剂与药物 降脂轻身方是郑州市中医院应用多年的院内制剂（豫药制字Z20130171 郑），其生产工艺完备且符合GAP 标准，经检验合格，颁发《医疗机构制剂许可证》，编号201500102。制法为苍术、白术、枳实粉碎成细粉，过100 目筛；茯苓等其余15 味药材加水煎煮2 次，第1 次加10 倍水量，煎煮1.5 h，滤过，滤液浓缩至相对密度1.25（80 ℃）的浸膏，70 ℃干燥，加入上述药物药粉，混匀，装胶囊。显微镜下发现，草酸钙簇晶大而多，直径20～160 μm，有的至190 μm（生大黄）；菊糖表面现放射状纹理，小型草酸钙方晶存在于薄壁细胞中（木香）；上下表皮细胞表面观呈多角形，上下表皮均有平轴式气孔，副卫细胞大多为2 个；非腺毛单细胞，基部稍弯曲；纤维周围薄壁细胞中含草酸钙方晶形成晶鞘纤维（番泻叶）。取本品内容物13 g，加正已烷30 mL 超声处理15 min，滤过，滤液水浴浓缩至约2 mL，作为供试品溶液；另取白术对照药材0.5 g，加正己烷2 mL 超声处理15 min，放置，取上清液作为白术对照药材溶液；再取苍术对照药材0.5 g，与白术对照药材相同的方法制成苍术对照药材溶液。按照薄层色谱法（2015 年版《中国药典》 四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液各10 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（30∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果，供试品色谱在白术、苍术对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。

1.3 体质量、血脂水平检测 小鼠饲养16 周后眼眶取血处死，分离血清，全自动生化分析仪检测血清低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、甘油三酯（（TG）、血清总胆固醇（TC）水平。

1.4 微阵列测序以及差异基因筛选 采用博奥晶典人类长链非编码RNA 芯片V4 检测。Feature Extraction 提数软件进行预处理分析，GeneSpring GX 软件计算基因表达差异和统计学显著性P值。根据分组信息进行差异比较，以差异倍数FC≥2.0，P≤0.05 为标准进项筛选，得到差异基因；FC（abs）值差异倍数越大，说明两个样品之间的差异越大；P越小，说明差异基因的可靠性越高。采用Cluster3.0软件，进行Cluster 分析和图形化展示。

1.5 GO 分析 将筛选出的差异mRNA 导入https：／ ／david.ncifcrf.gov／数据库，进行GO、KEGG 富集分析，从生物进程（biological process）、细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）3 层结构描述基因产物功能，并进行KEGG（KEGG pathway analysis）代谢通路分析。

1.6 共表达分析 共表达（correlation）分析的基本方法是将探针在各样品中的标准化信号值作为数据源，进行两两相关性计算和假设验证，得到相关系数和P值。相关性算法采用Pearson 法，P值默认不进行多重校正，其筛选标准为Correlation＞0.99 或Correlation＜-0.99，P＜0.05。挑选上述共表达结果中关联度最大的前1 000 个关系对，采用Cytoscape 软件绘制其网络图。

1.7 靶基因预测 在“1.6”项下结果的基础上，cis-预测寻找基因组位置在10 kb 之内的lncRNA-mRNA 对，trans-预测利用blast 工具对lncRNA、mRNA（3 ‘UTR）序列进行比对，筛选序列相似的lncRNA-mRNA 对。挑选上述靶基因预测结果中关联度最大的前1 000 个关系对，采用Cytoscape 软件绘制其网络图。

1.8 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用one-way ANOVA 检验。P＜0.05为差异具有统计意义。

2 结果

2.1 体质量、血脂 与正常对照组比较，模型组小鼠体质量升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药组小鼠体质量降低（P＜0.05，P＜0.01），见图1A。与正常对照组比较，模型组小鼠血清TC 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药组小鼠血清TC 水平降低（P＜0.05），见图1B。与正常对照组比较，模型组小鼠血清TG 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药组小鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），见图1C。与正常对照组比较，模型组小鼠血清LDL-C 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药组小鼠血清LDL-C 水平降低（P＜0.05），见图1D。2 组血清高密度脂蛋白（HDL）水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1E。

图1 各组小鼠体质量、血脂变化

2.2 基因差异 共筛选出496 个表达上调的差异mRNA、1 595个表达下调的差异mRNA、892 个表达上调的差异lncRNA、502 个表达下调的差异lncRNA，见图2。

图2 基因热图

2.3 基因本体论 以P＜0.05 为筛选标准，生物进程中显示出有375 个相关term，其中前4 个term 有RNA 剪接、核酸代谢过程、细胞大分子代谢过程、mRNA 代谢过程；细胞组分中显示出有77 个相关term，其中前4 个有细胞内、膜界限的细胞器、细胞内部分、细胞内膜结合的细胞器；分子功能中显示出有125 个相关term，其中前5 个有RNA结合、核酸结合、杂环化合物结合、有机环状化合物结合、聚（A）RNA 结合。见图3A。

以P＜0.05 为筛选标准，预测出22 个KEGG 信号通路，其中前20 个为泛素介导的蛋白水解、Hippo 信号通路、非小细胞肺癌、细胞周期、乙型肝炎、酮体的合成和降解、mTOR 信号通路、肾细胞癌、RIG-I 样受体信号通路、胶质瘤、蛋白质在内质网中的加工、ErbB 信号通路、剪接体、p53 信号通路、泛酸和CoA 的生物合成、多巴胺能突触、胰腺癌、鞘脂信号通路、mRNA 监控途径、慢性粒细胞白血病。见图3B。

2.4 共表达分析 共表达分析是以数学中相关性为基础，从基因表达层面寻找表达谱相似的lncRNA-mRNA 关系对。大量功能相关的基因在相关的一组条件下有非常相似的表达谱，特别是被共同的转录因子共同调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体，或者参与相同的调控路径。因此，共表达分析及基于共表达结果的网络构建可发现lncRNA 与mRNA 之间可能存在的作用关系，找到影响mRNA 表达调控的lncRNA，从而发现网络中起中心调控作用的lncRNA 及发现lncRNA 可能存在的新作用机制。

使用cytoscape 软件绘制网络图，发现gi ｜ 755474360、NONMMUT009611、NONMMUT024238、NONMMUT032729、NONMMUT039056、NONMMUT047338、NONMMUT050579、NONMMUT072360、ri ｜ 2310003C21、ri ｜ B130051E08 这10个lncRNA 与100 个mRNA 存在相互调控的共表达关系。见图4。

2.5 靶基因预测 采用反式调控预测（trans 预测），通过blast 筛选出在序列上和目标lncRNA 互补的mRNA，再以RNAplex 计算2 条序列之间的互补能量，最终得到498 对可能与目标lncRNA 稳定结合的mRNA。再采用cytoscape 软件进行筛选作图，建立起334 个节点靶基因相互调控图，其中Yod1、Zfp874b、Haus2、Strbp、Rbm34、Rmdn1、gi ｜755510242、NONMMUT024722、ri ｜ 6330564D18、ri ｜A630047B03、ri ｜ F830013G24、ri ｜ G370004A16 关系度均大于10。见图5。

3 讨论

高脂血症又称血脂异常，包括高胆固醇血症、高甘油三脂血症、低高密度脂蛋白血症和混合型高脂血症4 种类型［8］。高脂血症可作为代谢综合征的组分之一，与肥胖症、2 型糖尿病、高血压、冠心病、脑卒中等多种疾病密切相关［9］。

目前认为高脂血症属中医学“膏脂”“脂浊”“痰浊”等范畴［10］。中医认为高脂血症属于本虚标实，其主要病机是痰浊血瘀，致使肝脾肾虚，阻滞经脉，从而使膏脂布化失度［11］。降脂轻身方配伍严谨，全方体现了化痰除湿、泻浊逐瘀之治法。但降脂轻身方作用的分子机制尚不明确，本研究从lncRNA 与mRNA 表达谱变化，来探讨改善高脂血症的分子机理。

通过对模型组与给药组的ApoE-／-小鼠的肝脏组织差异基因筛选以及聚类，可以观察到两组数据组间序列差异明显、组内序列具有相似性，分类明确，说明降脂轻身方对高脂血症模型的调节作用显著；Y 轴上相邻的差异基因被聚为一类，其生物序列相近、功能以及生物特性具有相似性。聚类的结果可以为相关基因功能分析提供支持，从而为明确该药物发挥调节高脂血症的分子机制提供依据。

经GO 分析发现，给药组与模型组的差异基因在细胞器中涉及到RNA 剪接、mRNA 代谢等核酸代谢以及细胞大分子代谢的过程中发挥RNA 结合、有机环状化合物以及杂环化合物结合等分子功能；在KEGG 生物途径富集分析中，RIG-I 样受体、p53、ErbB、mTOR 和Hippo 信号通路被显著性富集。有研究表明：抑制Hippo 信号通路可诱导肝脏细胞的分化、增殖、凋亡发生发展［12］，而Hippo 通路的末端效应器通过抑制YAP-SREBP 复合物的功能，对肝细胞脂肪生成产生负作用［13-14］。有文献报道［15］，Hippo 信号途径的功能障碍诱导肝细胞中单酰甘油脂肪酶（Monoacylglycerol lipase，MAGL）的过表达，MAGL 则是通过脂肪酸氧化参与脂质代谢的关键酶。这与我们的研究结果近似，在降脂轻身方的作用下，差异基因显著富集出Hippo 信号通路，提示通过Hippo 信号通路可能是该方起到治疗高脂血症作用的靶点之一。

图3 GO 分析

lncRNA-mRNA 共表达网络是分析lncRNA 功能和调控机制的重要方式，提示我们聚为一类的基因通过共表达在基因转录中受到相似的调控。本研究中gi ｜755474360 等十个lncRNA 在降脂轻身方的作用下，通过共表达网络调控着多个mRNA 的表达，从而发挥着不同的生物学功能。

lncRNA 通过调控靶基因mRNA 的转录、稳定性等多种方式影响其靶基因的表达［16］。本研究通过DAVID 数据库对lncRNA 所对应的靶基进行功生物功能分析，得到以下结果：在细胞核以及胞质内ri ｜G370004A16 ｜ FL00003K09 ｜3994 参与转录调节、DNA 模板化生物进程，发挥金属离子结合的功能；在细胞核中ri ｜6330564D18 ｜ PX00044K21 ｜1545 参与转录以及转录调节、DNA 模板化等生物进程，执行金属离子结合与核酸结合功能；NONMMUT054817 在细胞核中参与转录调节、DNA 模板化生物进程；NONMMUT024722 在细胞核中参与转录以及转录调节、DNA 模板化、DNA 修复蛋白去泛素化以及运输等生物进程，执行聚（A）RNA 结合、金属离子结合、核酸结合、锌离子结合、巯基依赖泛素水解酶活性、巯基依赖泛素特异性蛋白酶活性等分子功能。有研究报道［17］：大鼠肝脏中铜和铁离子发挥抗氧化剂的作用抑制呼吸并增加自由基介导的线粒体磷脂过氧化；二氯化钴诱发急性化学缺氧可加重非酒精脂肪肝小鼠的肝脏损伤；肝脏中内质网钙离子代谢失衡使得产生内质网应激反应，可能是缺氧诱导脂类代谢障碍的调控途径。提示我们在降脂轻身方的作用下，ri ｜G370004A16 等lncRNA 分别在细胞核与细胞质中通过参与金属离子（例如锌、钙）结合、核酸结合等过程发挥对mRNA 转录及转录调控，从而调控着脂质代谢的生理作用。

图4 共表达网络图

图5 靶基因预测

综上所述，通过对lncRNA 与mRNA 表达谱的分析发现，降脂轻身方对肝脏脂质代谢的调节作用明确。其分子机制可能通过Hippo 等信号通路的信号转导以及lncRNAmRNA 分子网络来发挥其调节脂代谢作用；gi ｜755474360等共表达网络中的lncRNA 可能发挥了调控mRNA 的作用从而调节肝脏脂质代谢；NONMMUT024722 等靶基因可能通过参与金属离子结合、核酸结合等方式来发挥对mRNA 转录及转录调控从而参与肝脏脂质代谢。