片仔癀调控肿瘤细胞凋亡与增殖的途径

刘妙华，周步高，栾思宇，刘馥春，刘端勇，赵海梅

（1.江西中医药大学，江西南昌 330004；2.江西中医药大学科研处，江西南昌 330004；3.江西中医药大学科技学院，江西南昌 330004；4.江西中医药大学中医学院，江西南昌 330004）

片仔癀为我国传统名贵中成药之一，主要由牛黄、天然麝香、三七、蛇胆等名贵药材炼制而成，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的功效［1］。现代药理研究证实，片仔癀有着抗肿瘤、保肝护肝、抑制肝再生、解热抗炎、脑保护、促进乙醇代谢等作用，临床上肝癌、结肠癌、食道癌、肝炎等疾病均可用其来治疗［2］。

近年来，调控肿瘤细胞凋亡与增殖的途径在各种癌症发病及其治疗中的作用是当前研究热点之一。细胞凋亡［3］是机体为稳定内环境所进行的主动消亡过程，可通过细胞线粒体、细胞内质网应激、死亡受体等通路介导的机制发生凋亡，其中前两者属于内源性凋亡通路，而后者属于外源性凋亡通路。它有助于维持机体内细胞数量动态平衡，保证器官组织生长发育、免疫系统、新陈代谢、非正常细胞清除的正常运营，对生理性胚胎发育、免疫细胞分化、自身免疫系统维持、肿瘤发生、神经系统损伤等具有重要意义［4］；细胞增殖也是生物体中的重要生命特征之一，主要以细胞分裂的方式源源不断地产生新细胞，以替换体内衰老或死亡的细胞；并且其与增殖之间的相互作用是生物体内细胞正常新陈代谢、维持机体细胞数量动态平衡的重要机制［5］，当这种动态平衡被打破、调控基因异常表达时，会导致细胞凋亡被抑制，细胞无限增殖分化，从而产生肿瘤细胞，故诱导肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞增殖是相关治疗的重要途径［6］。本文就片仔癀调控肿瘤细胞凋亡与增殖的途径作一综述，以期为该方的保护和进一步开发提供依据。

1 片仔癀对肿瘤细胞凋亡与增殖的调控效果

1.1 促进肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡是一种自主的有序性死亡，由基因控制为稳定机体内环境而进行的生物学现象。陈炳艺［7］观察Hoechst 33342 染色后的MG63／ADM 细胞发现，片仔癀干预后细胞核相继呈现胞核聚缩、月牙状改变、典型凋亡小体的现象，提示该方可使MG63／ADM 细胞凋亡加速。在片仔癀调控人卵巢癌OVCAR-3 细胞凋亡实验［8］中，流式细胞术检测结果显示对照组中OVCAR-3 细胞早期凋亡率为0，而经过250、500、1 000 μg／mL 片仔癀处理24 h后，其凋亡率分别6.6%、30.9%、43.2%，呈现明显的剂量依赖性，也提示了该方可促进OVCAR-3 细胞凋亡。

1.2 抑制肿瘤细胞增殖 细胞增殖是机体生长、发育、繁殖以及遗传过程中不可或缺的一部分。在片仔癀对大肠癌细胞HT-29、HCT-8／5-FU 和HCT-8 细胞生长的研究中，MTT 实验结果显示该方能明显地抑制HT-29、HCT-8／5-FU、HCT-8 细胞增殖，并具有明显的剂量依赖性［9-10］；HCT-8／5-FU 细胞数明显减少，体积也有不同程度的缩小，甚至发生悬浮、脱落而死亡的现象，均与药物剂量呈正相关，进一步证实了该方对人结直肠癌细胞的增殖有抑制作用。

2 片仔癀调控肿瘤细胞凋亡与增殖的途径

2.1 激活线粒体凋亡途径 线粒体在作为细胞呼吸链和氧化磷酸化核心的同时，更是扮演着脊椎动物细胞凋亡中枢调控者的角色。在线粒体膜内外Bcl-2 家族成员的相互介导下，可导致线粒体膜通透性发生变化，跨膜电位下降，细胞色素C 和其他蛋白从线粒体膜内向外释放，最终激活线粒体凋亡途径［11］。张燕等［12］在片仔癀影响骨肉瘤U2OS细胞实验中发现，细胞线粒体膜电位可被不同剂量片仔癀降低，并与其剂量呈正相关，降低率分别为10.07%、19.57%、24.90%，并随着其剂量升高凋亡率明显上升，表明该方可呈剂量依赖性地下调线粒体膜电位，从而介导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡。

2.2 抑制STAT3 途径 STAT3 信号被激活后，可转位进入细胞核内与DNA 的反应原件联合，参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡等一系列生理过程［13］，但其持续性激活可促进细胞增殖，加速恶性转化，抑制细胞凋亡，导致肿瘤发生发展，而且Bcl-2、Bcl-xl 等抗凋亡基因的表达会随着STAT3 信号的激活被促进，进而抑制肿瘤细胞的凋亡。研究表明，片仔癀可呈剂量依赖性地降低p-STAT3、Bcl-2 表达，从而达到抑制舌鳞癌Tca8113 细胞增殖的作用［14］，可能是通过抑制STAT3 通路来实现。

2.3 抑制PI3K／Akt 通路 PI3K／Akt 信号通路在调控细胞生长增殖、阻碍细胞凋亡的过程中承担着重要作用，并且在多种肿瘤中异常表达［15］。Akt 作为PI3K 信号通路中的关键因子，其磷酸化水平提高可导致其下游蛋白分子（如Bad、caspase-9、NF-κB、mTOR 等）发生一系列变化，引起细胞增殖、分化、凋亡效应［16］，同时抑癌基因类脂磷酸酶PTEN 可使Akt 的磷酸化被阻断，使PI3K／Akt 信号通路失活，导致细胞凋亡［17］。陈炳艺等［18］报道，片仔癀处理48 h 后可明显上调PTEN 在人骨肉瘤耐药细胞MG63／ADM中的表达，并下调p-Akt 表达，表明该方可通过影响PTEN、p-Akt 表达来调控PI3K／AKT 信号通路，从而达到抑制MG63／ADM 细胞增殖、促进凋亡的效果；林海英等［19］也证实了片仔癀干预后可使PI3K、p85α、Akt 蛋白磷酸化被抑制，导致PI3K／Akt 信号失活，最终诱导骨肉瘤U2OS 细胞凋亡。

2.4 抑制Notch 通路 Notch 信号通路属于跨膜受体信号通路家族，具有高度保守性，对细胞增殖、分化、凋亡所发挥的关键调控作用主要是通过介导细胞间相互作用实现的，它主要由Notch 受体、配体、调节因子、相关转录因子等组成［20］，其配体与受体相结合后被激活，可引起Notch 蛋白裂解，并转移至细胞核，与转录因子RPB-Jκ 结合形成复合物，从而激活其下游靶基因Hes、Hey、Herp 等转录与表达，最终引起细胞分化、增殖、凋亡等过程［21］。研究表明，片仔癀能显著抑制大肠癌干细胞中Notch1 和Hes1 的表达，并随其剂量增加而细胞增殖率下降，提示该方可能是通过调控Notch 通路来抑制大肠癌干细胞的增殖，促进大肠癌干细胞的凋亡及分化［22］。

2.5 抑制Wnt／β-catenin 通路 Wnt／β-catenin 通路是一条高度保守的信号通路，与细胞增殖分化和机体平衡密切相关［23］，亦是调控大肠癌干细胞生长的主要通路之一［24］，大肠癌干细胞增殖及致瘤都与其相关。其中，β-catenin 是该通路发挥调节作用的关键蛋白，有研究发现Lgr-5 是大

肠癌干细胞的重要标记蛋白，也是维持其致瘤性的关键因子［25］。魏丽慧［26］报道，片仔癀干预后的大肠癌干细胞密度减少，活力及成瘤能力均下降，与对照组相比β-catenin、Lgr-5 的mRNA 及蛋白表达明显降低，表明该方可通过抑制Wnt／β-catenin 通路来达到抑制大肠癌干细胞增殖的效果。

3 片仔癀调控细胞凋亡与增殖的相关基因与蛋白

3.1 Caspase 家族 Caspase 家族是引起细胞凋亡的关键调控蛋白酶之一，被相关信号通路激活后能使Caspase 随之进入级联反应，降解细胞内蛋白质，引发细胞凋亡行为。研究表明，随着片仔癀剂量的逐渐增加，骨肉瘤MG63 细胞中caspase-3、caspase-9 表达均明显提升，提示该方能通过调控caspase-3、caspase-9 表达来诱导骨肉瘤MG63 细胞凋亡［27］。Lin 等［28］也证实了片仔癀能呈剂量依赖性地激活caspase-3 的表达，刺激细胞凋亡的分子级联效应，诱导人类结肠癌HT-29 细胞株死亡。

3.2 Bcl-2 家族 Bcl-2 家族能调控线粒体中细胞色素C 等凋亡基因的释放，是线粒体参与的凋亡途径中的关键效应因子，可通过多种途径来介导细胞凋亡，如线粒体、细胞内Ca2+水平、氧化自由基（ROS）、Bcl-2／Bax 等。实验表明，骨肉瘤MG63 细胞经片仔癀处理后，Bcl-2 蛋白表达呈明显的下降趋势，而Bax 表达明显升高，并且随着其剂量增加Bax／Bcl-2 也逐渐上升［27］，提示该方可通过调控Bcl-2、Bax 表达来促进MG63 细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。

3.3 p53 蛋白家族 p53 蛋白家族在预防癌症方面起着重要作用，能在细胞有丝分裂G 期监视DNA 完整性，是一种抑癌基因，若监测到有损伤，则促使细胞自我修复；但若损伤过大，则不能完全复原DNA，p53 会诱导其凋亡。有研究发现绝大多数大肠癌患者组织和细胞中PNO1 基因的表达往往会有显著性的升高，且实验表明通过片仔癀处理可使PNO1沉默并激活P53 通路，导致P53 及其下游P21 表达明显上调［29］，进而诱导细胞凋亡，达到抑制肿瘤生长的目的。

3.4 Ki-67、HGF mRNA Ki-67 是细胞增殖的标志物，它除了在细胞静止期G0期不表达外，在细胞分裂的G1、S、G2、M 期中均有表达［30-31］。在片仔癀预处理后的70%肝切除小鼠中发现，肝组织中Ki-67、肝细胞生长因子（HGF）mRNA 表达明显下降，表明该方能抑制残余肝组织细胞的增殖［32］；庄群川等［9］在片仔癀干预后的移植瘤组织中发现，Ki-67 蛋白表达明显下降，表明该方可通过下调Ki-67蛋白水平来抑制肿瘤细胞增殖。

4 展望

片仔癀可通过激活线粒体凋亡途径、抑制STAT3 通路、PI3K／Akt 通路、Notch 通路、Wnt／β-catenin 通路等多种途径及相关靶基因与蛋白来影响肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等过程，而这些信号调控肿瘤细胞增殖与凋亡引起的功能与状态紊乱在自身免疫性疾病、癌症等发生过程发挥了重要角色，可为该方治疗包括肿瘤在内的其他疾病、拓展其临床主治范围提供了参考依据。另外，这几条通路存在多个关联点［33-38］，并最终都能起到调控肿瘤细胞增殖与凋亡的作用（图1），但它们之间具体是如何关联起来发挥调控作用尚不明确，这也是今后课题组研究方向。

图1 片仔癀调控肿瘤细胞凋亡与增殖相关信号通路的关联图

目前，关于片仔癀调控细胞凋亡与增殖方面的研究尚停留在以肿瘤为主的信号通路干预方面，而对该方调控的明确靶点和相关基因、肿瘤和炎症微环境、与细胞凋亡密切相关的细胞自噬和焦亡、调控细胞凋亡与增殖的有效组分和部位等方面的研究还不够深入，也不够明确，而且是否具有更加适宜的剂型也是目前困扰相关新药研发的关键性问题。因此，加快片仔癀在其他疾病细胞凋亡与增殖方面中的药理学研究、有效组分和部位的筛选挖掘、剂型改造等对保护和开发该方具有深远而现实的意义。