HPLC 法同时测定黄花石蒜不同部位中3 种生物碱

刘 霞龙雨青曾 娟李 灿郎培蕾刘湘丹 周日宝∗

（1.湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208；2.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南长沙 410208）

黄花石蒜Lycoris aureaHerb.，又名忽地笑，生长在阴暗潮湿的斜坡和石缝中，为石蒜科石蒜属多年生草本植物［1-2］。具有解毒消肿、止咳祛痰、利尿、催吐的功效，可用于咽喉肿痛、痈肿疮毒、疔疮结核、小便不利、水肿、烫火伤、食物中毒、毒蛇咬伤、风湿性关节炎等［3-4］。黄花石蒜中主要的药用成分为生物碱类，包括石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏等，具有极高的药用价值［5］。其中，石蒜碱是一种苄基苯乙胺类生物碱，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗疟疾、镇痛、保护心血管等作用［6-9］，在临床上多用于小儿麻痹后遗症的治疗；加兰他敏为含有3 个光学活性碳原子的苄基苯乙胺类生物碱，具有可逆性和选择性抑制乙酰胆碱酯酶（ACHE）及调节烟碱型乙酰胆碱受体的双重作用，可改善认知和记忆功能，有助于治疗轻、中及重度阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），还可以用于治疗逆转神经肌肉阻滞、重症肌无力和小儿麻痹后遗症等疾病［10-12］；力可拉敏为加兰他敏的二氢衍生物，与加兰他敏有相似的药理作用，具有抑制胆碱酯酶作用，可以治疗小儿麻痹后遗症、重症肌无力、外伤性截瘫等，且毒性小于加兰他敏［13］。

文献资料表明，黄花石蒜鳞茎中加兰他敏等生物碱含量丰富。目前国内工厂生产加兰他敏等生物碱大都选用黄花石蒜地下鳞茎，鳞茎为一次收益不可再生，致使黄花石蒜不能循环采收，过度采挖导致野生资源匮乏。随着临床用药量逐年增加，仅凭依赖挖掘野生资源、扩大黄花石蒜植物的种植面积等方法来获取加兰他敏已不能满足临床需求［14］。本课题组前期发现，不同部位中加兰他敏含量存在差异，在花中最高［15-16］。因此，进行扩大用药部位研究存在可行性。

2020 年版《中国药典》 一部未收载黄花石蒜，没有含量测定项，难以整体控制药材质量。而HPLC 法具有高效、灵敏度高、操作简便、准确性高等优点。近年来，采用HPLC 法研究石蒜科加兰他敏单一成分的报道逐渐增多［17-18］，对石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏三者的同时测定研究较少，且存在分离效果不佳的缺点。而对浏阳市大围山黄花石蒜不同花期不同部位中3 种生物碱同时测定尚未见报道。因此，本研究采用HPLC 法对大围山野生黄花石蒜不同花期不同部位石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏的含量进行测定，改进提取方法及其洗脱条件，建立有效分离的液相条件，以期为后续黄花石蒜人工栽培及合理开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 LC 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；JY3002 电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；DZKW-S-6 型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；Eco-S15 和泰超纯水机（上海和泰仪器有限公司）；SB25-12DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；LG-08A 型高速中药粉碎机（瑞安市百信药机器械厂）；101-3AB 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 石蒜碱（批号R17M9F61708）、加兰他敏（批号Y28S6Y17770）、力可拉敏（批号W10M10Z87843）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。甲醇为色谱纯；氨水、氢氧化钠、磷酸、乙酸乙酯均为分析纯；蒸馏水、超纯水为实验室自制。

黄花石蒜于2018 年7 月采自湖南省浏阳市大围山，经湖南中医药大学药学院周日宝教授鉴定为石蒜科石蒜属黄花石蒜Lycoris aureaHerb.。将黄花石蒜花蕾期不同部位（全花、花葶、鳞茎）及盛开期不同部位（全花、花被、雄蕊、雌蕊、子房、花梗、不定根、花葶、鳞茎）于60 ℃烘箱内烘干，粉碎，过60 目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Supersil ODS-B C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10% A；10～15 min，10%～40% A；15～20 min，40% A；20～23 min，40%～10% A；23～28 min，10% A）；体积流量1.0 mL／min；检测波长6～10 min，230 nm；0～6、10～28 min，289 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏对照品12、6、3 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解，加入100 μL 氨水，甲醇稀释定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得质量浓度分别为1.2、0.6、0.3 mg／mL 的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取药材粉末0.5 g，精密称定，置离心管中，加1.0 mL10% 氢氧化钠溶液碱化15 min，加15 mL 乙酸乙酯室温下超声60 min，过滤后55 ℃水浴挥干，残渣加甲醇溶解，加入100 μL 氨水，甲醇定容至10 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性试验 精密量取供试品、混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，发现样品中石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏色谱峰与其他峰能达到基线分离，分离度良好。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下3 种溶液各3 mL，置于10 mL 量瓶中稀释并定容至刻度，加甲醇氨水溶液制成贮备液并稀释，精密吸取10 μL，在“2.1”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验 精密称取同一批药材粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，每次10 μL，测得石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏峰面积RSD 分别为1.78%、1.55%、1.54%（n＝6），表明仪器精密度良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下于0、2、4、6、8、12 h 进样，测得石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏峰面积RSD分别为2.37%、1.36%、0.88%（n＝6），表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 精密称取同一批药材粉末0.5 g，平行6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，测得石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏含量RSD 分别为1.40%、2.27%、2.31%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取生物碱含量已知的药材粉末0.25 g，平行6 份，加等量对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.5 样品含量测定 按“2.3”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

由此可知，花蕾期不同部位中力可拉敏含量为0.004 5%～0.025 1%，全花中含量最高，鳞茎中含量最低，前者约为后者的5.58 倍；加兰他敏含量为0.023 8%～0.124 2%，全花中含量最高，鳞茎中含量最低，前者约为后者的5.22 倍；石蒜碱含量为0.138 9%～0.306 2%，全花中含量最高，花葶中含量最低，前者约为后者的2.20 倍。盛开期不同部位中加兰他敏含量为0.015 4%～0.179 7%，全花中含量最高，鳞茎中含量最低，前者约为后者的的11.67 倍；力可拉敏含量为0.006 5%～0.035 8%，全花中含量最高，花葶中含量最低，前者约为后者的5.51 倍；石蒜碱含量为0.153 9%～0.500 6%，子房中含量最高，鳞茎中含量最低，前者约为后者的3.25 倍。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含量测定结果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3 讨论

3.1 前处理方法优化 对水、甲醇、无水乙醇、75%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等不同溶剂进行了提取效果的比较。结果表明，极性较小的乙酸乙酯、二氯甲烷提取物杂质较少且所提石蒜碱、加兰他敏及力可拉敏提取率较高，分离度佳，故采用乙酸乙酯溶剂提取3 种生物碱。

对比回流提取法［19］、离心处理法、微波提取法［20］、超声波提取法、酶辅助提取法［21］等多种样品前处理方法时发现，它们均存在提取时间长、步骤复杂、易破坏有效成分、有机溶剂用量大等缺点。碱化-有机溶剂提取法［22-23］简单易行、提取溶剂较少，提取效率最高，效果良好。

3.2 色谱条件优化 使用紫外检测器在200～800 nm 范围内进行紫外吸收全波长扫描，结果加兰他敏、力可拉敏最大吸收波长均为230 nm，石蒜碱最大吸收波长为289 nm，因此本研究选择230、289 nm 进行双波长检测。先后考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1% 磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸盐缓冲液、甲醇-0.9% 三乙胺溶液。最终选用甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，3 种生物碱均在10 min 内出峰，在保证整体出峰效率的同时，石蒜碱、加兰他敏及力可拉敏与其他物质分离效果良好，峰形较好，出峰时间较短，且方法学稳定。

3.3 3 种生物碱含量比较 黄花石蒜不同花期不同部位中生物碱的含量具有明显差异，花蕾期不同部位石蒜碱的含量为全花＞鳞茎＞花葶；加兰他敏、力可拉敏的含量均为全花＞花葶＞鳞茎。盛开期不同部位石蒜碱的含量为子房＞全花＞花梗＞花被＞雄蕊＞雌蕊＞不定根＞花葶＞鳞茎；加兰他敏的含量为全花＞子房＞花被＞雄蕊＞雌蕊＞花梗＞不定根＞花葶＞鳞茎；力可拉敏的含量顺序为全花＞子房＞花被＞不定根＞雄蕊＞雌蕊＞花梗＞鳞茎＞花葶。

结果表明同花期同部位3 种生物碱含量以石蒜碱最高，加兰他敏次之，力可拉敏最低；不同花期相同部位3 种生物碱的含量均呈现盛开期高于花蕾期的规律；同花期不同部位石蒜碱、加兰他敏及力可拉敏的含量积累差异明显，且这3 种生物碱的含量主要富集于花中，远远大于传统入药部位鳞茎。采用花部位替代鳞茎作为提取加兰他敏等生物碱原料，具有可多年反复采收，保证野生植株的可持续利用，降低了生产成本及时间成本的优点。后续研究或生产中可考虑花部位替代鳞茎作为提取原料，具有更广阔的应用前景。