UPLC-MS／MS 法同时测定痹痛宁胶囊中4 种生物碱

赵 丽 肖 婷张建强武道圆刘 学周 威吴林菁沈祥春茅向军陶 玲∗

（1.贵州医科大学，贵州省天然药物资源高效利用工程中心，贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价特色重点实验室，贵州医科大学-贵阳市联合重点实验室，天然药物资源优效利用重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省食品药品检验所，贵州贵阳 550004；3.贵州恒霸药业有限责任公司，贵阳国家高新技术产业开发区金阳知识产业园，贵州贵阳 550008；4.贵州省药品监督管理局检查中心，贵州贵阳 550081）

痹痛宁胶囊由马钱子粉、全蝎、僵蚕、麻黄、苍术、乳香、没药、川牛膝、刺五加浸膏、甘草10 味药材组成，适用于寒湿阴络所致的痹病症，具有抗炎、镇痛作用［1-4］，方中马钱子粉主要成分为士的宁、马钱子碱，具有毒性，而盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱也属于毒性、麻醉类成分。因此，建立痹痛宁胶囊中上述4 种生物碱含量的测定方法，并控制其范围，对保证临床疗效和用药安全具有重要意义。

痹痛宁胶囊现行质量标准 ［WS3-228（2-032）-20012-2］仅对士的宁含量进行了测定，难以全面反映该制剂中士的宁、马钱子碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的特征，而且关于其多成分定量分析的报道也较少［5-8］，大多采用HPLC 法，前处理方法也较复杂［9-11］；GC-MS 法分析时间较长，并采用SIM 模式扫描，定量也不如MRM 模式精准［12］。因此，本实验建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）法同时测定痹痛宁胶囊中上述4 种生物碱的含量，该方法灵敏度高，专属性好，分析周期短，提取方式简便，可为建立该制剂更全面的质量标准提供借鉴。

1 材料

XEVO-TQ 型超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XP26 型痕量分析天平、XS105DU 型电子分析天平（0.001 mg）［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；100～1 000 μL移液器（德国Eppendorf 公司）；D24UV 型纯水仪（美国Millipore 公司）。

士的宁（批号10705-200306，纯度97%）、马钱子碱（批号110706-200505，纯度95.7%）、盐酸麻黄碱（批号171241-201508，纯度99.8%）、盐酸伪麻黄碱（批号 171237-201208，纯度99.9%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。痹痛宁胶囊（贵州恒霸药业有限责任公司，批号20181001、20181201、20181202、20190103、20190201、20190202、20190401、20190402、20190403、20190501、20 190502；黑龙江乌苏里江制药有限公司，批号20190501、20190502、20190506、20190507、20190508）。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯（德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 分别精密称取士的宁、马钱子碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品4.178、3.300、3.714、3.852 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，即得（各成分质量浓度分别为0.417 8、0.330 0、0.371 4、0.385 2 mg／mL）。

2.1.2 供试品溶液 取胶囊10 粒，倾出内容物后研细，混匀，精密称取0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水-浓盐酸（50∶50∶1）混合溶液20 mL，称定质量，超声（500 W、40 kHz）处理15 min，放冷，混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1 mL，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 UPLC-MS／MS 条件

2.2.1 色谱 ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相水（含0.1%甲酸）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～6 min，4.0% A；6～7 min，4.0%～18.0% A；7～9 min，18.0%～55.0% A；9～10 min，55.0%～100.0% A；10～12 min，100.0% A；12～13 min，100.0%～4.0% A，13～15 min，4.0% A）；体积流量0.3 mL／min；柱温40 ℃；进样量0.3 μL。

2.2.2 质谱 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测（MRM）模式；离子源温度150 ℃；去溶剂气温度500 ℃，体积流量1 000 L／h；锥孔气体积流量50 L／h；碰撞气体积流量0.15 mL／min；毛细管电压0.3 kV。其他参数见表1，总离子流色谱图、MRM 色谱图分别见图1～2。

表1 各成分MS 参数Tab.1 MS parameters for various constituents

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取马钱子碱对照品溶液0.2 mL、士的宁对照品溶液0.25 mL，置于同一20 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀；精密吸取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液各0.5 mL，置于同一200 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取前2 种溶液0.1、0.4、0.7、1.0、1.3 mL，后2 种溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，置于5 个10 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列质量浓度溶液（士的宁0.050 66、0.202 6、0.354 6、0.506 6、0.658 6 mg／L，马钱子碱0.031 58、0.126 3、0.221 1、0.315 8、0.410 6 mg／L，盐酸麻黄碱0.009 266、0.018 53、0.037 07、0.074 13、0.148 3 mg／L，盐酸伪麻黄碱0.009 620、0.019 24、0.038 48、0.076 96、0.153 9 mg／L），在“2.2”项条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），各成分质量浓度为横坐标（X）进行回归，并分别以S／N ＝3、S／N ＝10 为检测限、定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图2 各成分MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of vrious constituents

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.3.1”项下对照品溶液，在“2.2”项条件下进样测定8 次，测得士的宁、马钱子碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积RSD 分别为0.4%、0.5%、0.5%、0.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 精密称取同一批胶囊（批号20181001），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2”项条件下进样测定，测得士的宁、马钱子碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积RSD 分别为1.5%、1.2%、1.9%、1.6%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取同一批胶囊（批号20181001），按“2.1.2”项下方法平行制备8 份供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，测得士的宁、马钱子碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量RSD 分别为1.2%、1.0%、1.1%、0.8%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取含量已知的胶囊（批号20181001）约0.1 g，精密称定，共9 份，加入高、中、低质量浓度对照品溶液，每个质量浓度3 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

2.4 样品含量测定 精密称取各批胶囊，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

3 讨论

3.1 流动相筛选 本实验考察了乙腈-水、乙腈-水（含-0.1%甲酸）等流动相系统，发现乙腈-水（含-0.1%甲酸）洗脱时各成分均显示较高的检测灵敏度和较好的峰形。另外，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱为同分异构体，可产生相同的二级碎片离子，故调整乙腈-水（含-0.1% 甲酸）比例为4∶96，两者分离度可达到要求。

3.2 提取方法筛选 本实验考察了三氯甲烷（加2 mL 氢氧化钠溶液）加热回流2 h、甲醇-水-浓盐酸超声30 min［13］、50%甲醇（加2 mL 氢氧化钠溶液）加热回流2 h［14］、50%甲醇（加2 mL 氢氧化钠溶液）超声30 min、甲醇超声30 min，1.44%磷酸超声30 min［15］，发现甲醇-水-浓盐酸超声30 min时，各成分提取都较为完全，而且更快速简便，毒性较低。在此基础上，进一步考察甲醇-水、浓盐酸比例，发现50%甲醇提取时各成分提取最完全，而在不同比例浓盐酸（0.5、1、2）下其含量无显著差异。最终确定，提取溶剂为甲醇-水-浓盐酸（50∶50∶1）。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝3）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝3）

表4 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3.3 含量限度制定 士的宁、马钱子碱均为毒性成分，而且前者有效剂量、中毒剂量比较接近［16-20］。2015 年版《中国药典》 规定，马钱子粉中士的宁质量分数应为0.78～0.82%，日用量为0.3～0.6 g，即相当于2.4～4.8 mg，而痹痛宁胶囊日用量为0.8 g，故测得该成分高限值为6.0 mg／g。16 批样品中士的宁、马钱子碱平均质量分数分别为3.88、2.65 mg／g，据经验按80%计，两者低限值分别为3.1、2.1 mg／g。因此，建议痹痛宁胶囊中士的宁质量分数范围为3.1～6.0 mg／g，而马钱子碱质量分数不得少于2.1 mg／g。

盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱是国家严格管制的毒性、麻醉类成分［21］，2015 年版《中国药典》 规定，麻黄中两者总量不得少于0.80%。痹痛宁胶囊中麻黄所占比例为6.1%，折算成盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱总量应不得少于0.49 mg／g，故建议以其为这2 种成分含量的限度。