外泌体及其内容物对胃癌发生、发展的作用

赵梓岐 倪坤明 付伟伟 丁士刚

北京大学第三医院消化科(100183)

胃癌是全球范围内多发的恶性肿瘤，早期症状隐匿不易发现、晚期预后相对较差，是严重威胁人类健康的疾病之一。流行病学研究[1]显示，2019年我国胃癌发病率为43.1/10万，居全国恶性肿瘤发病率第2位，死亡率达29.6/10万，防治形势较为严峻。胃癌是一种多因素导致的疾病，目前已知主要危险因素包括环境危险因素和个人危险因素，前者包括膳食因素、吸烟、幽门螺杆菌感染、职业暴露、胃部手术等，后者包括家族易感性、基因多态性以及胃溃疡、恶性贫血等疾病。胃癌的一般发病机制涉及由慢性胃炎发展至慢性萎缩性胃炎，进而进展为假幽门腺化生、肠化生、异型增生等癌前病变的一系列过程。胃癌发生的相关分子学机制仍未完全明确，是多年来的研究热点之一。诸多研究证实，外泌体在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展中扮演着关键角色。本文就外泌体及其内容物对胃癌发生、发展的作用作一综述。

一、外泌体的生物学特性

外泌体是直径为30～150 nm的细胞外囊泡，几乎所有类型的细胞均可产生，其由包含跨膜蛋白并包裹胞质蛋白、脂质或核酸的脂质双层组成。最初，外泌体被认为是丢弃细胞中废物的场所。现有研究[2]则表明，在生理和病理条件下，外泌体可通过转运特定的外泌体内容物，如蛋白质、DNA、mRNA、非编码RNA等，来调节局部和远处的细胞通讯。近年诸多研究[3-4]显示，外泌体是肿瘤发生、生长、血管形成以及远处转移的重要介质，与人类的正常生理稳态和包括癌症在内的多种疾病密切相关。

外泌体的生物发生始于质膜的内向出芽，形成含有膜蛋白的早期内含体。随着内含体内陷和特定蛋白质、核酸的封闭，形成多囊体。此后上述两种微泡与质膜发生融合，并向胞外释放外泌体。多囊体形成的调节在内体分拣转运复合体(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)的驱动下完成，ESCRT包括约30种蛋白质，在真核生物中具有保守性。此外，与外泌体形成有关的机制亦有神经酰胺途径、4次跨膜蛋白途径等。概括而言，外泌体是一类细胞外信号体，在正常生理环境中可促进真核细胞间的广泛生物通讯；而在恶性肿瘤中，此种调节机制可影响癌细胞的存活和生长[5]。

二、 外泌体影响胃癌发生、发展的机制

肿瘤的发生与肿瘤微环境有密切联系，而外泌体可通过多种途径作用于肿瘤微环境，进而影响肿瘤的发生、发展。肿瘤微环境是肿瘤细胞及其周围正常细胞、基质等的总称，主要包括肿瘤细胞、T细胞、巨噬细胞等免疫细胞、血管内皮细胞、周细胞、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibro-blasts, CAFs)、脂肪细胞、细胞外基质等[6]。胃癌细胞自身及其所处的肿瘤微环境内的多种细胞均可产生外泌体，经多种机制促进或抑制胃癌的发生、发展。

1. 调节肿瘤细胞生长增殖：CAFs是肿瘤微环境的重要组成部分，可通过分泌成纤维细胞活化蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等为肿瘤细胞创造适宜的增殖环境，从而促进肿瘤转移和血管生成。CAFs的来源主要包括组织内原有成纤维细胞、间质干细胞分化以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。胃癌细胞源性外泌体可诱导胃黏膜毛细血管周细胞的增殖、迁移，并增加周细胞的CAFs相关标记物表达，进而通过介导运输骨形态发生蛋白-2激活PI3K/Akt、MEK/ERK通路，促进周细胞向CAFs转化[7]。此外，胃癌来源的外泌体亦可通过TGF-β/Smad通路诱导人脐带来源的间充质干细胞(hucMSCs)向CAFs分化[8]。

此外，外泌体调节肿瘤细胞生长的机制亦包括：胃癌细胞源性外泌体和内含微RNA(miRNA)可通过CD97上调ERK、JNK、p38等MAPK通路关键成员的磷酸化水平、激活下游蛋白表达，促进胃癌细胞增殖并增强其侵袭力[9]；胃黏膜上皮细胞产生的外泌体可功能性转运高毒力幽门螺杆菌菌株的毒力因子CagA蛋白,促进其进入其他胃黏膜细胞，此可能与早期胃癌的发生有关[10]。

2. 调节肿瘤相关免疫功能：体内巨噬细胞分为M1、M2表型，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、脂多糖(LPS)、干扰素-γ(IFN-γ)等可使单核细胞分化为M1表型，发挥吞噬杀伤微生物、分泌炎性因子、刺激特异性免疫、抑制肿瘤生长等功能；而巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、IL-10等则可使单核细胞分化为M2表型，具有促进基质重编程、组织修复、血管生成、增强肿瘤生长的作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在肿瘤微环境中主要呈现M2表型，可分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TGF-β、血管内皮生长因子(VEGF)、IL-10以及多种趋化因子，从而促进肿瘤细胞增殖和转移、抑制相关免疫功能、促进血管生成等[11]。研究[12]发现，胃癌源性外泌体可促进PD1+TAMs的产生以及TAMs向M2表型转化，继而增加IL-10分泌、抑制CD8+T细胞功能，有利于肿瘤细胞增殖。此外，体内胃癌源性外泌体可通过激活NF-κB通路来促进巨噬细胞表型转换，进而诱导肿瘤细胞的增殖和侵袭[13]。

髓系来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一类未成熟的髓系细胞，可抑制T细胞活性。胃癌外泌体通过减少CD8+T细胞与自然杀伤细胞(NK细胞)数量、增加CD4+T细胞数量、募集MDSCs来产生免疫抑制微环境。CD8+T细胞是针对肿瘤的关键免疫细胞。有研究[14]显示，肿瘤来源的外泌体改变基因表达和细胞因子分泌模式可能与肿瘤源性外泌体内容物富集有关。此外，胃癌细胞源性外泌体可激活Hsp72/TLR2通路、进而诱导MDSCs以增加IL-6的分泌，通过自分泌途径进一步增强其免疫抑制作用。

此外，有研究[15]发现，含人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的胃癌细胞源性外泌体作用于Toll样受体4(TLR4)，可激活NF-κB通路，使体内中性粒细胞自噬作用增强，同时促进其极化为N2表型以发挥促进肿瘤细胞增殖、转移以及抑制肿瘤免疫的功能。经胃癌细胞源性外泌体刺激后，MDSCs一方面可上调CD69、CD25等与T细胞激活有关的表面标记物表达，另一方面可抑制单个核细胞增殖，从而激活人髓系白血病单核细胞(THP1细胞)和巨噬细胞，增加多种前炎性因子表达[16]。

3. 调节肿瘤血管生成：一方面，肿瘤源性外泌体可转运多种血管生长相关因子以调节肿瘤血管生成，如VEGF、基质金属蛋白酶(MMP)以及多种miRNA，亦可通过抑制低氧诱导因子-1(HIF-1)等表达，促进血管生成[17]；另一方面，部分肿瘤源性外泌体内含血管生成蛋白(ANG)，此为一种内切核酸酶，可参与新生血管形成、肿瘤发生、发展以及固有免疫调节等过程，同时对VEGF、表皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等多种血管生成因子发挥的效应具有允许作用[18]。

三、外泌体内容物对胃癌发生、发展的作用

1. 外泌体内蛋白：肿瘤源性外泌体内含多种调节细胞生长、分化以及维持其正常生理功能的蛋白，包括多种癌基因表达产物、酶、生物因子、热休克蛋白以及转录因子等，在肿瘤的发生、发展过程中起有重要作用。

①三次跨膜结构域(tripartite motif, TRIM): TRIM家族属于一类泛素连接酶，在细胞增殖、分化、凋亡以及DNA修复、转录调节等方面均发挥重要作用，其成员TRIM3具有抑癌功能。研究[19]发现，胃癌患者血清外泌体中TRIM3表达水平较健康人群有所下降，而TRIM3过表达可通过调控干细胞增殖分化、EMT等途径抑制胃癌的发生和转移。

②人胃动蛋白1(gastrokine 1, GKN1): GKN1是由胃黏液分泌细胞产生的一种胃特异性蛋白，可随黏液分泌至胃黏膜表面，在维持胃黏膜完整性和稳态、调节细胞增殖分化方面发挥重要作用，属抑癌因子。研究[20]表明，GKN1通过外泌体形式被胃黏膜分泌和内吞，可抑制胃癌细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。

③其他：在胃癌发生过程中，肿瘤附近浸润的M2巨噬细胞可高水平表达载脂蛋白E(ApoE)，并由外泌体将其转运至邻近癌细胞，从而激活PI3K/Akt信号通路，促进胃癌细胞增殖和转移[21]。在幽门螺杆菌感染后的胃癌细胞所释放的外泌体中，磷酸化形式的间质表皮转化因子(MET)表达水平明显升高，可通过刺激IL-1β分泌等方式促进TAMs表型转化、促进肿瘤生长和进展[22]。对p53敲除的骨髓间充质干细胞的研究[23]发现，其产生的外泌体可转运泛素蛋白连接酶E3成分N识别蛋白2(UBR2)至胃癌细胞和p53未敲除的干细胞，导致Wnt/β-catenin通路异常激活，发挥促进胃癌进展、转移以及增强胃癌细胞的干细胞性等作用。

2. 外泌体内RNA

①MiRNA：近年在外泌体内发现了多种miRNA，可被邻近或远处细胞吸收，起调节作用[24]。同时外泌体内miRNA亦具有相关的主动分拣机制，即miRNA的3’末端等特异序列可指导其整合入外泌体，而中性鞘磷脂酶-2(nSMase-2)、苏素化的核不均一核糖核蛋白(hnRNP)等分子亦可控制miRNA分拣[25]。外泌体miRNA在疾病进展中起重要作用，并能刺激血管生成、促进肿瘤转移[26]。除包装入外泌体或微泡外，miRNA亦可包装入高密度脂蛋白中，或与囊泡外AGO2蛋白结合，以上三者均可保护miRNA免受降解。这种通过循环囊泡传递信息的途径是细胞间通讯的第三种方式，与接触性信号转导和可溶性分子信号转导同等重要[25]。

外泌体中miRNA的功能可分为两类：一种是常规功能，即前述的负调节功能，可引起目标基因表达水平特征性变化；另一种是取决于miRNA种类的特异性功能，对于某些miRNA，当其作为外泌体内成分而非细胞内成分发挥作用时，此功能方能体现。外泌体中各种不同类型的miRNA在胃癌肿瘤微环境中发挥不同功能，如miR-423-5p可促进胃癌细胞增殖和迁移[27]、let-7 miRNA维持致瘤表型和转移潜能[28]、miR-130a促进血管生成和肿瘤生长[29]、miR-21抑制细胞凋亡[30]、miR-34过表达可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭以及运动[31]等。

②长链非编码RNA(lncRNA)：研究[32]发现，一种长度为26 bp的lncRNA X26nt含量在胃癌细胞源性外泌体中明显升高，其可转运入血管内皮细胞，进而降低细胞内血管内皮钙黏蛋白水平，促进细胞的增殖、迁移、血管形成等，加速肿瘤生长和血管生成。此外，研究[33]发现，胃癌患者血清分离的外泌体内lncRNA HOTTIP表达水平较健康人群升高，其具有作为胃癌生物标记物的潜力。

③环状RNA(circRNA)：近年研究[34]发现，在胃癌患者的癌组织和血清中，外泌体形式的circSHKBP1水平显著上升，且与疾病不良预后相关。该分子属于circRNA，在体内外均可发挥促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及血管生成的作用，其主要机制是通过miR-582-3p/HUR/VEGF通路增强VEGF mRNA的稳定性，同时直接与热休克蛋白90结合、阻抑其正常泛素化，最终引起胃癌进展加速。

总之，外泌体是参与胃癌发生、发展的多功能载体，内含种类丰富的RNA，可维持细胞恶性表型，促进肿瘤细胞增殖、转移、迁移、黏附，促进EMT、血管生成，促进成纤维细胞转化等[35]。

四、外泌体在胃癌诊疗中的应用潜力

1. 外泌体在生物标记物方面的潜力：近期研究揭示了外泌体内的多种内含物在胃癌的早期诊断、预后分析以及疗效评估方面可能具有重要的生物标记物潜力。

①DNA和蛋白质：研究[20]显示，GKN1在胃癌患者血清外泌体中的水平显著低于健康人群，且具有一定的鉴别胃癌患者与良性胃部疾病以及肝癌、结肠癌患者的能力，有望成为胃癌的特异性诊断标记物。另有研究[36]对胃液提取的外泌体内的DNA进行BARHL2甲基化分析，证实其可作为早期探测胃癌的临床标记物。

②MiRNA：有研究[37]发现miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p、miR-9-5p这4种血清外泌体miRNA组合的表达水平升高与早期胃癌的进展密切相关，可能成为新的早期胃癌的生物标记物。另有4种血清外泌体的组合为miR-10b-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p、miR-296-5p，其在胃癌诊断和预后方面的标记物意义已得到研究证实，在其水平上调后进行的辅助化疗可能会降低患者的总生存率[38]。研究[27]发现，胃癌患者血清外泌体内miR-423-5p含量显著升高，并与肿瘤细胞淋巴结转移和预后不良密切相关，可能成为胃癌的预后指标。

③LncRNA：近期研究[39-40]发现，lncRNA PCSK2-2∶1和lncRNA SLC2A12-10∶1在胃癌患者血清外泌体中的表达水平与健康人群有显著差异，前者与肿瘤体积、分期、静脉侵袭情况相关，可作为预测转移和预后的指标，而后者较传统诊断指标具有较高的敏感性，可作为新型的胃癌诊断指标。

2. 外泌体在靶向治疗方面的潜力：关于外泌体及其内容物在胃癌治疗中的潜力，目前研究主要集中在外泌体与胃癌细胞耐药性方面。顺铂是胃癌化疗的常用药物之一，胃癌患者对该药的初始反应良好，但大多数患者会随用药时间的延长而进展为对顺铂耐药，其机制包括药物吸收减少和外排增加、肿瘤细胞内活性药物成分减少、分子靶点改变、DNA损伤修复加强、前凋亡因子下调以及抗凋亡基因上调等。目前认为外泌体与此过程密切相关。由外周血单核细胞分化来的M2巨噬细胞可产生含有miR-21的外泌体，通过PTEN和PI3K/Akt等通路促进胃癌细胞产生对顺铂的耐药性[41]。而针对HEK293T细胞株的体外实验表明，外泌体可用作抗miR-214的转运载体，可能具有逆转胃癌对顺铂耐药性的作用[42]。此外，外泌体内含的c-Met siRNA可显著抑制胃癌细胞的侵袭性，并在体内、外实验中表现出部分逆转胃癌对顺铂耐药性的作用，有望成为胃癌的潜在治疗靶点之一[43]。

五、总结

综上所述，外泌体是细胞间物质交换与信息传递的重要渠道。通过内含的蛋白质、核酸等生物活性物质，外泌体可调节肿瘤细胞生长增殖、肿瘤相关免疫功能以及肿瘤血管生成，促进或抑制胃癌的发生、发展。利用多种方式针对外泌体形式的特定蛋白或核酸进行监测，可作为胃癌病变评估、疗效监测等的参考指标，展现出作为肿瘤早期标记物和治疗靶点的潜力。