虎耳草活性成分的提取及功效评价

张立萍， 佘秋钿， 范 敏，游瑞云， 刘 琳， 卢玉栋*

（1. 奢脉国际化妆品（北京）有限公司，北京 100000；2. 福建师范大学 化学与材料学院，福建省先进材料化工基础重点实验室，福建 福州 350117）

虎耳草［Saxifraga stolonifera (L.) Meerb.］是一种多年生的常绿草本植物，属于双子叶植物纲。虎耳草全草可入药，能祛风清热、凉血解毒，具有抗炎消肿、治疗湿疹、治冻疮、外伤止血、镇咳等多种药理活性[1]，还可作为细胞凋亡诱导剂，调控前列腺癌细胞的凋亡[2]。

虎耳草中含有的主要活性物质可分为三大类，分别是多酚类、黄酮类、有机酸类[3]。1988 年，罗厚蔚等人利用乙醇作为提取溶剂，回流提取虎耳草中的化学物质，经过有机溶剂萃取，层析分离得到岩白菜素、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素、原儿茶酸、没食子酸等8 种结晶化合物，其中槲皮素、槲皮苷均属于黄酮类化合物[4]。虎耳草中所含的黄酮类化合物能够起到消炎、抗氧化、抑菌、降低血管脆性、降血脂、治疗过敏、抗自由基等多种对生物活性有益的作用[5]。

虎耳草中活性成分的提取工艺主要有回流提取、超声提取、索氏提取和冷浸提取[6]、微波辅助萃取技术、膜分离技术和超微粉碎技术。对于虎耳草提取液中主要活性成分的分离，一是通过有机溶剂萃取进行分离，二是通过色谱分离纯化[7]。

现如今，虎耳草在市场上的应用较为局限，针对虎耳草应用受到限制的问题，需要深入探讨虎耳草中活性成分的功效，为虎耳草在高附加值领域的应用提供基础数据、提高其活性成分的广泛应用。本文提取虎耳草中活性成分，通过体外抑制小鼠单核细胞白血病细胞（简称Raw-Blue 细胞）的炎症产生、牛津杯法判断常见细菌对虎耳草的敏感程度以及体外测定羟基自由基的清除率[8]等方法从各方面评价虎耳草中活性成分的功效。

1 实验

1.1 实验仪器与药品

1.1.1 实验仪器

电热干燥箱，VIS-721，上海亚荣生化仪器厂；电子天平，CARY 50，Varian；721 可见分光光度计，RE-52A，上海佑科仪器仪表厂；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；细菌培养箱，福州科远贸易有限公司；超净操作台，苏州净化设备有限公司；集热式磁力搅拌器，DF-101S；无菌注射器，江苏康友医用器械有限公司；酶标仪，Spectra max Plus384，Molecular Devices。

1.1.2 实验药品

亚硝酸钠，AR，天津市瑞金特化学品有限公司；硝酸铝，AR，天津市红岩化学试剂厂；十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠，AR，上海展云化工有限公司；水杨酸，AR，上海实验试剂有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、芦丁标准品、六水合硫酸亚铁、抗坏血酸、过氧化氢，均为AR，国药集团化学试剂有限公司；虎耳草，安徽亳州中药材交易市场；菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，均由福建师范大学生命科学学院提供。L-多巴、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、蘑菇酪氨酸酶、脂多糖LPS、Raw-Blue 细胞、营养琼脂均为生工公司提供。

1.2 虎耳草活性成分的提取

1.2.1 冷凝回流法和冷浸法提取虎耳草

冷凝回流法：称取10.0 g 干燥虎耳草于一洁净圆底烧瓶中，在冷凝回流下按照料液比1∶13 慢速加入75%乙醇溶液，在70℃条件下反应2 h，抽滤得第一次虎耳草提取液。以料液比为1∶6 将75%乙醇溶液加到虎耳草的滤渣中，冷凝回流1.5 h 后抽滤，合并两次虎耳草提取液，浓缩干燥至固态。

冷浸法提取虎耳草活性成分：按照料液比取干燥虎耳草和75%乙醇溶液，混合后放置过夜，同样得到两次提取液并合并蒸发浓缩，得到的浓缩提取液密封冷藏备用。

本文后续实验都使用这两种方法提取的虎耳草合并溶液。

1.2.2 紫外分光光度计测定虎耳草提取液中总黄酮含量

以芦丁为标准样品测定总黄酮含量。量取3 mL 虎耳草提取液，随后依次各加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、NaOH 溶液、蒸馏水定容至25 mL。在波长为510 nm 条件下测定虎耳草提取液的吸光度，根据芦丁标准曲线方程式可得提取物中总黄酮的浓度，其中粗品虎耳草提取液中总黄酮的含量如式（1）所示。

式中，ρ为质量浓度，VR为溶剂体积，VS为提取物体积，VQ为稀释试样的溶液的体积，m为试样的质量。

1.3 虎耳草提取液抗氧化性能的测定

准确称取0.5 g 固态虎耳草提取液，用pH=6.8 的磷酸盐缓冲液溶解配制成0.4 mg/mL 虎耳草溶液。取11 个25 mL 容量瓶，依次向其中分别加不同体积虎耳草溶液，随后各加入2.5 mL 9.0 mM 水杨酸-75%乙醇溶液、9.0 mM 硫酸亚铁溶液、0.3%过氧化氢溶液启动反应，用蒸馏水定容至25 mL。在波长510 nm 测定其吸光度值Ax’，记录三组平行数据取平均值。维生素C 作为阳性对照实验。自由基清除率计算如公式（2）所示。

式中，A0为空白管的吸光度，AX为加入自由基清除剂后的吸光度。

1.4 虎耳草提取液的分离

固态虎耳草乙醇提取物溶于100 mL 蒸馏水中，用50 mL 丙酮沉淀部分皂苷后，蒸发浓缩、烘干。100 mL 蒸馏水重溶，按浸提液与萃取溶剂1∶1（V/V）依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂，在室温下萃取，得到的石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分萃取物，冷藏保存备用。

1.5 虎耳草提取液及不同溶剂萃取物的体外抗炎性能评价

将Raw-Blue 细胞以每孔5 000 个铺至96 孔板内，待细胞贴壁完全，加入虎耳草总提取液或者不同溶剂萃取物，培养2 小时。将炎症刺激物LPS 加入，培育24 小时。最后，将150 μL 显色液加入96 孔板中，取50 μL 的上清液，混匀后培养0.5～2 小时。根据吸光度变化程度评价虎耳草总提取液及不同溶剂萃取剂的体外抗炎活性。

1.6 虎耳草总提取液及不同溶剂萃取物的体外抑菌功效研究

采用牛津杯方法对70%乙醇溶液、虎耳草提取液以及不同溶剂的萃取液进行抑菌实验。

1.7 虎耳草有效成分对酪氨酸酶作用的研究

取2 mL L-多巴溶液，分别加入0.5 mL 不同浓度虎耳草提取液，浓度分别为250、500、1000、2000、4 000、5 000 μg/mL。接着分别加入0.5 mL 酪氨酸酶溶液，快速振荡摇匀，并在黑暗下反应至酶活力最大值。反应后在475 nm 处测定吸光值A’，平行记录三组数据并取平均值。以0.5 mL pH＝6.8 的磷酸缓冲溶液作为虎耳草不同浓度提取液的空白对照。根据各组在475 nm 下的吸光值可计算不同浓度虎耳草提取液对酪氨酸酶的抑制率（%）。抑制率可根据式（3）计算。

式中，各组 a: 磷酸盐缓冲液、L-多巴溶液、酪氨酸酶溶液；b: 磷酸盐缓冲液、L-多巴溶液；c: L-多巴溶液、虎耳草提取液、酪氨酸酶溶液；d: L-多巴溶液、虎耳草提取液、磷酸盐缓冲液。

2 结果与讨论

2.1 虎耳草提取液的固含量及总黄酮含量

采用冷凝回流法和冷浸法结合对干燥的虎耳草进行提取，并通过测定得其固含量和提取率分别为7.18 mg/mL 和14.9%。由于黄酮母核中多带酚羟基，酚羟基能和铝离子产生黄色络合物，实验采用芦丁作为对照品对总黄酮进行含量测定[9]，实验数据表明吸光度A值与芦丁浓度呈线性关系。以吸光度A值为纵坐标，对照品的浓度（C）为横坐标，绘制标准工作曲线，并得到线性回归方程A＝13.658C＋0.009 8，R2＝0.999 3。再根据实验所得的虎耳草提取液总黄酮含量为5.86%。

2.2 虎耳草提取液的抗氧化性能

为了探究虎耳草总提取液的抗氧化性能，本实验用羟基自由基的清除率来表示抗氧化性能的优劣。以维生素C 作为对照品，在波长510 nm 处对各溶液进行吸光值的测量。从原理上来看，溶液颜色越浅，测得的吸光值越小，则说明自由基的清除率越高，即抗氧化性能越好。根据分别添加的维生素C 溶液以及虎耳草提取液的浓度梯度与对自由基的清除率的数据绘出趋势图，如图1 所示。

从图1 中可知，虎耳草提取液在低浓度时，抗氧化性能不稳定，在较高浓度时具有与维生素C 相当的抗氧化性能，并且在相同实验条件下测得虎耳草提取液浓度为0.048 mg/mL 时，对羟基自由基的清除率达75.7%。

图1 不同浓度的维生素C 和虎耳草提取液对羟基自由基的清除率

图2 虎耳草总提取液及不同溶剂萃取物对炎症的抑制作用

2.3 虎耳草总提取液及不同溶剂提取物的抗炎性能

为了探究虎耳草总提取液对Raw-Blue 细胞的体外抗炎性能，本实验利用脂多糖LPS 作为炎症刺激物对Raw-Blue 细胞进行发炎刺激。实验中设置十组情况分别进行，这里将组名简称为空白、LPS、虎、虎+LPS、石、石+LPS、乙、乙+LPS、正、正+LPS，对应编号1 至10。通过酶标仪检测出细胞溶液体系的吸光值变化程度来判断测试样品中抗原的浓度，从而评价虎耳草总提取液以及它的不同溶剂萃取物的抗炎性能。

从图2 可以比较明显地看出，有加入虎耳草总提取液组和乙酸乙酯溶剂萃取物组比空白组测得的吸光值大幅度减小，这说明虎耳草总提取液及乙酸乙酯萃取物本身具有很好的抗炎性能。并且在加入炎症刺激物LPS 后，乙酸乙酯萃取物对细胞的炎症抑制作用与虎耳草总提取液的效果相近。

2.4 虎耳草总提取液及不同溶剂萃取物的抑菌性能

为了研究虎耳草总提取液的抑菌性能，本实验以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌三种常见细菌为试验菌种，运用牛津杯法对虎耳草总提取液进行抑菌性能检测。实验结果如表1 所示，虎耳草总提取液对三种较为常见的细菌均有抑菌活性，其中对大肠杆菌的抑制效果最佳。虎耳草总提取液的石油醚相萃取物对大肠杆菌的作用虽然稍强于对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑制作用，但总体表现为低敏。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对乙酸乙酯相与正丁醇相萃取物的敏感程度相当，而对于铜绿假单胞菌，正丁醇萃取物的抑制作用最明显。综合比较来看，虎耳草正丁醇相的萃取物抑菌性能最佳。

表1 牛津杯法对虎耳草总提取液及不同溶剂萃取物的抑菌性能检测（抑菌圈直径/ mm）

2.5 虎耳草提取液对酪氨酸酶的抑制作用

为了探究虎耳草提取液浓度对酪氨酸酶的酶活力抑制作用的影响，本实验设置了虎耳草溶液的梯度浓度，反应至酶活力活性最大值，通过对酶活力活性的测定，得到酶活力趋于稳定值的时间。从图3 可知，虎耳草提取液对酪氨酸酶的抑制率在浓度为4 000 μg/mL 处达到最大效果，抑制率为79.25%。提取液浓度在250～4 000 μg/mL时，对酶活力的抑制率逐渐增强，而浓度大于4 000 μg/mL时，对酶活力的抑制率迅速降低。说明虎耳草提取液在较低浓度时就表现出较好的抑制酪氨酸酶活力的功效，若能加入到护肤产品中，可以达到美白的效果。

图3 虎耳草提取液浓度对酪氨酸酶的影响

3 结论

1）通过回流提取与冷浸提取合并所得虎耳草提取物的固含量为7.18 mg/mL，提取率为14.9%。采用紫外分光光度计法，芦丁作为实验对照品，测得黄酮总含量为5.86%。

2）虎耳草提取液具有很好的抗氧化活性，与维生素C 进行比较，在低浓度时，维生素C 表现出强的抗氧化活性，而在稍高浓度时，虎耳草提取液的抗氧化性能与维生素C 相当。当虎耳草提取液浓度为0.048 mg/mL 时，对羟基自由基的清除率达到75.7%。

3）虎耳草总提取液及不同溶剂萃取物均具有不同程度的抗炎性能，其中，虎耳草总提取液乙酸乙酯萃取物能发挥最大的抗炎功效。

4）通过牛津杯法对虎耳草提取液的抑菌性能检测表明，虎耳草提取液能够抑制常见的普通细菌，具有一定的抑菌性能。具体地，虎耳草总提取液正丁醇萃取物抑菌性能最佳。

5）虎耳草提取液对酪氨酸酶的活性具有较强的抑制作用，测试体系在黑暗环境下反应30 min，使得酶活力达到最大、最稳定值。在提取液浓度为4 000 μg/mL 处达到最大抑制效果，抑制率为79.25%。