多巴胺D1 受体在频闪光诱导性近视发生发展中作用的研究

胡倩倩李炳佘曼李涛周晓东

(复旦大学附属金山医院,上海 201508)

近视是目前发病率最高的屈光不正,但其发生机制仍不清楚[1-2]。DA 作为一种眼内神经递质,是实验性近视发展过程中的一种重要调节因子[3]。多巴胺通过其两个受体家族发挥作用,即D1 类受体(D1DR)和D2 类受体(D2DR)。其中D1DR 主要分布在双极细胞、水平细胞、无长突细胞和神经节细胞,D1DR 中主要以D1 受体为主;而D2DR 分布在光感受器细胞、色素上皮细胞以及产生多巴胺的无长突细胞[4]。以往的研究中对近视发生过程中D2DR 的相关研究较多,而对D1DR 的功能尚不清楚。关于D1DR 是否参与实验性近视的形成过程及其作用,目前的观点并不统一[5-6]。有文献报道,D1DR 拮抗剂SCH 23390 可抑制正常视觉对实验性近视的缓解作用[7],但也有研究称SCH23390 不参与近视的过程[8]。近些年来有人提出D1 与D2 之间的平衡在近视的发生中更为重要[9],还有人发现SCH 23390 既可促进白化豚鼠的近视进展[6],也可促进C57BL/6 小鼠和花色豚鼠形觉剥夺性近视(FDM)的形成[10-11]。这些结果提示,D1DR 在屈光发育及FDM 的发生中可能产生重要作用。

由于先前关于DA 及其受体的研究主要集中在FDM 和LIM 两种近视模型中,且这两种近视模型所模拟的近视机制也不相同[12]。当前频闪光作为“光污染”的重要组成部分[13],密切影响着人类的视觉质量,频闪光诱导的近视也逐渐成为一种新的诱导因素引起的屈光异常。针对此种诱导因素,本实验通过建立豚鼠FLM 模型,检测视网膜D1DR 表达的变化,同时给予D1DR 拮抗剂进行干预,探讨D1DR在FLM 发生过程中的作用,并初步探索FLM 的潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

36 只2周龄普通级英国种短毛雄性三色豚鼠,体重90 ～110 g,购自上海市松江区松联实验动物场【SCXK(沪)2017-0008】,饲养在上海市公共卫生临床中心【SYXK(沪)2015-0008】。在温度24 ～26℃,相对湿度55% ～65%,光照周期12 h ∶12 h,光照强度0 ～600 lx 的环境中饲养。按实验动物使用的3R 原则给予人道主义关怀,并获得相关实验动物检验许可(公卫伦审【2020】2020-A029-01)。

1.1.2 主要试剂与仪器

异氟烷(瑞沃德,中国);戊巴比妥钠(Sigma,USA);多巴胺D1 受体拮抗剂SCH 23390(Sigma,USA);兔抗鼠D1 受体多克隆受体(货号:ab81296,Abcam,USA);即用型免疫组化试剂盒(批号:1311209902,福建迈新,中国);Anti-GAPDH 抗体(Abcam,UK);山羊抗兔二抗(康为世纪,中国)。

带状光检影镜(KJ6B,六六视觉,苏州);SUPER SW1000 眼科A 超测量仪(天津索维,中国);Western Blot 用电泳仪及转膜仪(Bio-rad,USA);ECL-Plus 成像系统(Merck Millipore,Germany);Acclaim C18 色谱柱(Thermo Fisher Scientific,USA);高效液相质朴分析仪(ChemStation,Agilent 公司,USA)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与处理

36 只豚鼠随机分为四组(n=9):(1)对照组(control group),不予特殊处理,开放饲养;(2)频闪光组(FLM group),参照邸悦等[13]的方法建立FLM模型;(3)频闪光+溶剂组(FLM + Vehicle group),频闪光环境中饲养,饲养过程中对豚鼠右眼进行玻璃体腔注射生理盐水(20 μL);(4)频闪光+D1DR 拮抗剂组(FLM + SCH 23390 group),频闪光环境中饲养,饲养过程中对豚鼠右眼进行玻璃体腔注射D1DR 拮抗剂SCH 23390(0.5 μmol/L),每次注射20 μL,注射药物剂量和浓度参照既往文献[8]。玻璃体腔注射方法[14]:用异氟烷麻醉豚鼠,使用25 μL微量注射器,于豚鼠右眼上方角膜缘后1 mm 处进针注入,进针深度约为3 ～5 mm。4 d 重复1 次注射,从造模第14 天到第42 天,共注射8 次。各组豚鼠均饲养6周。

1.2.2 眼球生物测量

在造模第1 天和第42 天分别测量各组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度,测量均采用单盲法。以第42天测量值减去第1 天测量值之差作为该眼生物参数变化值。

(1)屈光度的测量:测量前使用复方托吡卡胺滴眼液滴眼,5 min 滴1 次,共4 次,待瞳孔扩大后进行带状光检影验光[15],等效球镜记为球镜+ 1/2 柱镜,重复测量3 次后取平均值作为该眼屈光度值[15]。

(2)眼轴长度的测量:测量前用盐酸奥布卡因滴眼液进行角膜表面麻醉,再应用SUPER SW1000眼科A 超测量仪进行测量,A 超频率为11 Hz。测量时探头对准角膜中心并垂直于角膜平面。待图像稳定清晰时记录眼轴长度,每只眼重复测量5 次后取平均值,精确到0.01 mm。

1.2.3 取材

6周造模结束后,所有豚鼠均采用过量注射戊巴比妥钠进行安乐死,迅速摘取右眼球,一部分进行固定并制成石蜡切片,用于免疫组化检测,另一部分在冰块上快速分离视网膜,随后保存于-80℃冰箱中用于免疫印迹和HPLC-ECD 检测。

1.2.4 免疫组化染色

将石蜡切片依次经脱蜡,复水,灭活内源性过氧化物酶,抗原修复,封闭,一抗(D1DR,1 ∶1000)于4℃冰箱孵育过夜,二抗(1 ∶200 山羊抗兔)37℃孵育1 h,DAB 染色,苏木素染核,脱水及透明后封片,在光学显微镜下观察及拍照。

1.2.5 免疫印迹实验

将存放于-80℃的用于免疫印迹的视网膜组织取出,依次进行称重,总蛋白提取,浓度测定,制胶,电泳,转膜,免疫反应,蛋白质的化学发光检测后,于成像系统曝光,并用Quantity One 软件分析灰度值。

1.2.6 高效液相色谱电化学检测法

将待测的视网膜组织称重,按1:10 体积匀浆,12000 r/min 离心,取上清液每份20 μL,注入38℃Acclaim C18 色谱柱(2.2 μm,2.1 mm × 100 mm)中,用磷酸缓冲液流动相以0.2 mL/min 流速分离,检测室电压为+ 0.7 V,安全室电压设为+ 0.75 V。所有数据均由Chem Station 进行采集和分析。通过与提前设定的已知标准进行比较得出峰值及相对浓度。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件进行分析。实验结果以平均值± 标准差(±s)表示,并进行正态性检验。多组间数据的比较采用单因素方差分析(ANOVA),采用Levene 检验进行方差齐性检验,若方差齐则采用Bonferroni 法进行组间两两比较,若方差不齐则采用Dunnett’s T3 法进行组间两两比较;两组间数据的比较采用独立样本t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 眼生物参数变化

2.1.1 造模前后四组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度

造模前,四组豚鼠右眼屈光度、眼轴长度均无显著差异(P=0.220);造模6周后,与对照组相比,频闪光组和频闪光+溶剂组屈光度显著降低(P＜0.001,P＜0.001),眼轴长度显著增长(P=0.02,P＜0.001);而频闪光+ D1DR 拮抗剂组的屈光度和眼轴长度均无显著差异(P=0.182,P=0.12)。与频闪光组相比,频闪光+溶剂组屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义(P=1.0,P= 0.95);频闪光+D1DR 拮抗剂组屈光度值显著升高(P=0.003),眼轴长度无显著差异(P=1.0)(见表1)。

表1 造模前后各组豚鼠右眼生物参数Table 1 Biological parameter values of the right eyes in the guinea pigs before and after the treatment

2.1.2 造模6周后各组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度变化值的比较

6周造模结束后,四组豚鼠屈光度和眼轴长度的变化值为:对照组(-1. 70 ± 2. 38)D,(0. 24± 0. 05)mm;频闪光组(-9. 36 ± 2. 10)D,(0. 50± 0. 17)mm;频闪光+溶剂组(-8. 40 ± 2. 72)D,(0. 52 ± 0. 15) mm;频 闪 光+D1DR 拮 抗 剂 组(-3. 88 ± 1. 52)D,(0. 26 ± 0. 15)mm。与对照组相比,频闪光组、频闪光+溶剂组屈光度变化值和眼轴长度变化值均有显著差异(P＜0. 001,P=0. 011;P＜0. 001,P= 0. 002),频闪光+ D1DR拮抗剂组的屈光度变化值和眼轴长度变化值均无显著差异(P= 0. 271,P= 0. 999)(图1)。与频闪光组相比,频闪光+溶剂组屈光度变化值和眼轴长度变化值均无显著差异(P= 1. 0,P=1. 0);而频闪光+ D1DR 拮抗剂组屈光度变化值和眼轴长度变化值有显著差异(P＜0. 001,P=0. 042)(图1)。

图1 造模6周后各组豚鼠右眼生物参数变化值Note. A. Changes of refraction values of the right eyes in the four groups. B. Changes of axial length values of the right eyes in the four groups. Compared with the Control group, ∗P＜0.05, ∗∗P＜0.001. Compared with the FLM group, #P＜0.05, ##P＜0.001. (The same in the following figures)Figure 1 Changes of biological parameter values of the right eyes in the guinea pigs after 6 week treatment

图2 频闪光处理6周后,豚鼠视网膜D1DR 相对表达变化Note. A. Retinal sections were immunostained to analyze the effects of flickering light on the expression of retinal D1DR in the guinea pigs. B. The expression of D1DR was quantitatively analyzed by Western Blot.Figure 2 Changes of D1DR relative expression in the retina of guinea pigs after 6 week treatment

2.2 频闪光处理6周后豚鼠视网膜中D1DR 的相对表达变化

6周造模结束后,通过免疫组化法检测D1DR在对照组和频闪光组豚鼠视网膜中的表达情况,结果显示:频闪光组视网膜内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)D1DR(棕黄色)表达较对照组明显增多。运用免疫印迹法测得两组豚鼠视网膜D1DR 的蛋白表达变化,与对照组相比,频闪光组D1DR 相对表达量明显升高(P=0.001)(见图2)。

2.3 造模后四组豚鼠右眼视网膜DA 含量及其代谢的变化

6周造模结束后,采用HPLC-ECD 测得四组豚鼠右眼视网膜DA、DOPAC 含量分别为:对照组(n=6),(81.54 ± 8.60)pg/mg,(66.87 ± 7.98)pg/mg;频闪光组(n=6),(173.88 ± 32.06)pg/mg,(69.61± 18.36)pg/mg;频闪光+溶剂组(n=6),(186.33 ±8.48) pg/mg,(73.80 ± 17.18) pg/mg;频闪光+D1DR 拮抗剂组(n=6),(108.32 ± 14.95)pg/mg,(59.34 ± 5.63)pg/mg。与对照组相比,频闪光组、频闪光+溶剂组、频闪光+D1DR 拮抗剂组DA 含量显著升高(P=0.003,P＜0.001,P=0.027)(见图3A),且DOPAC/DA 比值显著降低(均P＜0.001)(见图3C);与频闪光组相比,频闪光+溶剂组DA 含量及DOPAC/DA 比值无显著差异(P=0.91,P=1.0)(见图3A、3C),而频闪光+D1DR 拮抗剂组DA含量显著降低(P=0.013)且DOPAC/DA 比值明显升高(P=0.02)(见图3A、3C)。各组间DOPAC 含量差异没有统计学意义(P＞0.05)(见图3B)。

图3 造模6周后各组豚鼠右眼视网膜DA、DOPAC 含量及其比值Note. A. Levels of DA in the retina of guinea pigs. B. Levels of DOPAC levels in the retina of guinea pigs. C. DOPAC/DA ratio in the retina of guinea pigs.Figure 3 Retinal DA, DOPAC levels and DOPAC/DA ratio in the right eyes of guinea pigs after 6 week treatment

3 讨论

我们的研究观察到:豚鼠FLM 的过程中视网膜D1DR 表达上调、DA 含量升高以及DOPAC/DA 比值降低,选择性D1DR 拮抗剂SCH 23390 能降低视网膜DA 含量并增加DOPAC/DA 比值,从而抑制豚鼠FLM 的进展,抑制眼轴长度的变化。

既往的一些研究认为D1DR 参与了多种实验性近视的形成,使用D1DR 激动剂或拮抗剂能够促进或者抑制实验性近视的进展。比如:Jiang 等[6]在白化豚鼠自发性近视的基础上发现SKF38393 在100 ng时能抑制近视的发展,SCH 23390 在2500 ng时能促进近视的发展。Darbin 等[16]发现SKF38393能抑制小鸡FDM,SCH23390 可促进小鸡FDM。这些研究表明,拮抗D1DR 对实验性近视的进展可能具有促进作用。然而,本研究发现拮抗D1DR 可能对近视的进展具有抑制作用,这与上述研究不同。此外,也有报导支持我们的研究。如:刘银[17]也发现全身敲除D1DR 会影响小鼠正常屈光发育而发生远视偏移。熊薇薇[18]的研究结果显示,SKF38393以及SCH23390 均可以抑制小鼠FDM 的进展。这些研究表明D1DR 在实验性近视的形成中具有重要意义,但其在不同近视模型中发挥的作用可能不一致,原因可能与不同类型近视的不同诱导因素有关。此外,动物种属及药物剂量的不同也可能是产生差异的原因。本研究发现豚鼠FLM 中视网膜D1DR 的表达增多,这与我们前期研究的发现一致[19]。通过玻璃体腔注射D1DR 拮抗剂能够抑制FLM 的进展,使近视程度明显减轻,眼轴延长显著减少。这说明D1DR 参与了豚鼠FLM 的形成。

然而,D1DR 参与近视形成的机制仍不清楚。既往的研究认为DA 作为视网膜中的一种重要神经递质,是眼球增长的STOP 信号[20]。有研究用HPLC-ECD 测量形觉剥夺的小鸡视网膜中DA 和其代谢产物的含量,发现DA 及DOPAC 含量都明显低于正常组[21],而当鸡形觉剥夺恢复后,视网膜的DA和DOPAC 含量又恢复。这说明在FDM 模型中,可能是由于DA 含量缺乏导致近视,而通过玻璃体内注射DA 则可以抑制FDM 的发展[3]。然而,与FDM相反,Luo 等[19]发现豚鼠FLM 过程中伴随着视网膜DA 含量的升高,推测FLM 的发生可能与DA 的过度增加有关。研究表明,频闪光刺激能够引起DA的释放。比如Kramer[22]发现,给予猫以恒定的光刺激DA 的释放被抑制,而给予频闪光却刺激其DA的释放。Puppala 等[23]把斑马鱼的视网膜从黑暗环境移至频闪光环境中,发现DA 释放增多。Kirsch等[24]也发现频闪光能刺激鱼视网膜中DA 的产生。与我们之前的研究一致,本研究发现频闪光刺激导致豚鼠视网膜DA 含量的增多及DA 转化率的降低,推测FLM 的发生机制可能是过多频繁的强光刺激引起视网膜的感光异常,从而导致大量DA 不断合成,但分解代谢减少,进而导致过多的DA 累积,而过多的DA 可能会给视网膜带来不良影响甚至损害进而引起屈光不正。

在本研究中,玻璃体腔给予D1DR 拮抗剂后,FLM 豚鼠眼球的近视样改变受到抑制,且视网膜DA 含量下降,DOPAC/DA 比值升高。我们推测由于频闪光刺激使得豚鼠眼内DA 增多及D1DR 表达增强,过多的DA 与D1DR 结合后激活下游分子通路,导致豚鼠发生近视。所以当使用D1DR 拮抗剂SCH 23390 时,DA 及其D1DR 受到抑制,进而使得下游信号通路被抑制,最终使近视样改变得到抑制。有研究表明,SCH 23390 可使斑马鱼脑中DA及DOPAC 水平明显下降[25],这提示:SCH 23390 处理后,可能伴有DA 及DOPAC 水平的变化。因此,多巴胺D1 受体可能通过影响DA 及其代谢水平而参与豚鼠FLM 的发生发展。

本研究提示D1DR 参与了豚鼠FLM 的形成。拮抗D1DR 能够抑制豚鼠FLM 的进展。此外,D1DR 激动剂对FLM 的进展会有何作用,这是我们今后关注的一个内容,我们将进一步探讨D1DR 在FLM 中的作用及其机制,从而为近视的防治提供更多的实验依据。