广藿香对感染后肠易激综合征大鼠内脏高敏感作用及机制研究

刘瑶，卢素宏，欧阳蒲月

（广东食品药品职业学院，广东广州510520）

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种最常见的胃肠道功能紊乱性疾病，该病患病率高、病程长、易反复、治疗困难、严重影响生活质量，引起人们广泛重视[1]。患者被肠道病毒、细菌或寄生虫等感染，在病原体清除及黏膜炎症逐渐消退后，出现IBS症状，称之为感染后肠易激综合征(post⁃infectious irritable bowel syndrome,PI⁃IBS)。PI⁃IBS发病机制复杂，内脏高敏感是PI⁃IBS症状产生的核心机制[2]。本课题组前期研究结果表明，藿香正气液、广藿香油、广藿香醇均能不同程度地修复PI⁃IBS大鼠肠黏膜机械屏障，调节肠道免疫异常和菌群失调，藿香正气制剂可作为治疗PI⁃IBS的理想药物[3]。广藿香Pogostemoncablin(Bl anco)Benth.是藿香正气方中的君药，在治疗PI⁃IBS中起主要作用。现代药理学研究表明，广藿香具有调节胃肠道功能和抑菌抗炎作用[4]。但广藿香能否显著改善PI⁃IBS内脏高敏感性，广藿香不同提取物（广藿香水提液、广藿香油）对PI⁃IBS大鼠肠道脊髓转入神经通路的影响是否有差异，均有待于进一步研究。因此，本课题在前期研究的基础上，深入研究广藿香对PI⁃IBS大鼠内脏高敏感的调控作用及其机制，为广藿香合理应用于PI⁃IBS临床治疗提供实验数据支持，为中医药对PI⁃IBS的认识以及诊疗方案提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Sprague⁃Dawley大鼠，体质量180～200 g，雄性，购自广东省实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2013⁃0002。动物于20～24℃，湿度60%～70%，12 h明暗的环境中适应性饲养3 d后开始实验。

1.2 药物与试剂

广藿香药材采自广东省高要市。广藿香挥发油制备：取广藿香地上部分，晾干剪碎后，精密称取碎叶置于蒸馏瓶中，加入适量蒸馏水，按《中国药典》规定的挥发油测定法提得黄色油状物，出油率为1.5%。广藿香水提液的制备：收集广藿香挥发油提取后的滤渣，滤渣用蒸馏水煎煮3次并过滤，弃去滤渣，合并滤液，为广藿香水提液。马来酸曲美布汀片（开开援生制药股份有限公司，批号13032817）；CRF、CGRP、5⁃HT检测试剂盒（上海仁捷生物科技有限公司，货号分别为：c12031、c12421、c12311）；BDNF一抗（英国Abcam公司，货号：ab122424）；ECL检测试剂盒（美国ThermoFisher公司，批号：32019）；其他试剂均为国产分析纯，由广州浩玛生物科技有限公司提供。

1.3 主要仪器

5810R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；Synergy HT多功能酶标仪（美国BioTek公司）；POW⁃ER/PAC 1000电泳仪、POWER/PAC Universal电转装置、GS⁃800光密度扫描仪（美国BIO⁃RAD公司）；MP150型多导生理记录分析系统（美国BIOPAC公司）。

1.4 方法

1.4.1 分组、造模及给药方法 40只大鼠随机分为5组，即正常组、PI⁃IBS模型组、马来酸曲美布汀片（TMT）组[0.1 g/(kg·d）]、广藿香油组[3 g/(kg·d）]、广藿香水提物组[6 g/(kg·d）]，每组8只。参考课题组前期文献复制PI⁃IBS模型[5]。造模成功后第2天开始给药，正常对照组和PI⁃IBS模型组给予生理盐水灌胃，药物组给予相应药物灌胃，每日1次，连续7 d。

1.4.2 大鼠结肠运动能力和内脏敏感性测定 于建模前、给药前及给药后测定大鼠2 h内排出的粪粒数和结肠运动。大鼠2 h内排便的粪粒数：清早未刺激前2 h内大鼠排便的粪粒数。大鼠结肠运动的描记：将橡胶小囊与直径为2 mm的塑料导管连接，将塑料导管与三通管（一端接压力换能器，另一端接1 mL的注射器）连接，注射器注入水，排净气泡，将压力换能器与多导生理记录仪相连，记录30 min结肠运动的曲线。然后计算连续30 min的曲线下面积为大鼠的结肠运动指数(motility index，MI)。用药前及用药结束后进行内脏敏感性评估，行直肠气囊扩张（colon rectal distension，CRD），根据腹部回缩反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分标准[6]确定疼痛压力阈值。

1.4.3 ELISA检测结肠中CRF、CGRP、5⁃HT含量 实验结束后，麻醉后量取距肛门8 cm处取结肠组织2 cm。加3倍体积生理盐水匀浆后，按照ELISA试剂盒的操作说明检测CRF、CGRP、5⁃HT含量。

1.4.4 Western blot检测大鼠海马中BDNF表达 实验结束，麻醉后取脑组织。按说明书提取蛋白并测定浓度。每孔上样50μg，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗溶液（BDNF 1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，10 min/次，3次，HRP标记的二抗溶液（1∶15 000）室温孵育2 h，上述方法洗膜后加入ECL液显色曝光。

1.4.5 统计学处理 采用SPSS13.0 for windows统计软件对数据进行处理，实验数据用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析及LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 广藿香提取物对大鼠结肠运动的影响

造模前，各组大鼠2 h内排出的粪粒数和结肠MI无差异。造模后，PI⁃IBS大鼠排出的粪粒数和结肠MI较正常组显著增加(P＜0.01)。给药后，广藿香油组、广藿香水提物组、TMT组大鼠2 h内排出粪粒数和结肠MI较模型组均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。广藿香油组、广藿香水提物组大鼠2 h内粪粒数明显多于TMT组，大鼠结肠运动指数也明显高于TMT组。结果见表1、表2。

2.2 广藿香提取物对大鼠内脏敏感性的影响

与正常组相比，用药前各组大鼠直肠扩张时的疼痛阈值明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明造模成功。与模型组相比，广藿香油组、广藿香水提液组、TMT组疼痛阈值明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。广藿香油组、广藿香水提液组与TMT组之间差异无统计学意义。结果见表3。

表1 各组大鼠2 h内粪粒数（个）Table 1 Number of fecal particles in each group within 2 h(±s，n=8)

表1 各组大鼠2 h内粪粒数（个）Table 1 Number of fecal particles in each group within 2 h(±s，n=8)

与正常对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与TMT组比较：△P＜0.05。

组别正常对照PI⁃IBS模型TMT广藿香油广藿香水提物剂量/（g·kg⁃1）--0.1 3 6建模前4.7±1.16 4.6±1.27 4.5±0.97 4.8±0.79 4.6±0.85给药前4.5±1.08 7.5±1.35**7.6±1.71**7.4±1.89**7.3±1.57**给药后4.6±0.97 7.3±1.64**5.5±1.08##6.6±1.33#△6.7±1.32#△

表2 各组大鼠结肠运动指数Table 2 Colonic motility index of rats in each group（mmHg·s-1，±s，n=8）

表2 各组大鼠结肠运动指数Table 2 Colonic motility index of rats in each group（mmHg·s-1，±s，n=8）

与正常对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照PI⁃IBS模型TMT广藿香油广藿香水提物剂量/（g·kg⁃1）⁃ ⁃0.1 36建模前1 073.4±95.12 1 039.15±91.27 1 090.29±105.97 1 090.51±112.79 1 082.7±108.85给药前1 096.65±154.08 2 092.27±183.35**2 111.88±179.71**2 097.4±197.26**2 063.43±249.82**给药后1 086.22±93.47 2 112.15±107.2**1 470.92±86.85##1 870.12±85.93#△1 880.64±93.5#△

2.3 广藿香提取物对大鼠结肠组织中CRF、CGRP、5⁃HT的影响

表3 各组大鼠疼痛阈值（60 mmHg）Table 3 Pain threshold of rats in each group(±s，n=8）

表3 各组大鼠疼痛阈值（60 mmHg）Table 3 Pain threshold of rats in each group(±s，n=8）

与正常对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

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与正常组相比，PI⁃IBS大鼠结肠组织中CRF、CGRP和5⁃HT含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。给药后，广藿香油组、广藿香水提物组、TMT组结肠中CRF、CGRP和5⁃HT含量较模型组显著下降（P＜0.01或P＜0.05）。3个给药组大鼠的结肠中CGRP含量仍明显高于正常组（P＜0.01）。广藿香油组、广藿香水提液组与TMT组之间的差异无统计学意义。结果见表4。

2.4 广藿香提取物对大鼠脑组织中BDNF的影响

与正常组相比，模型组海马中BDNF表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，广藿香油组、广藿香水提液组和TMT组，海马组织中BDNF表达均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。广藿香油组、广藿香水提液组与TMT组之间的差异无统计学意义。结果见图1。

3 讨论

内脏高敏感性是指内脏器官对来自外周的各类伤害性刺激和正常生理性刺激的感觉阈值降低、感受性加强的现象。现代研究表明，内脏高敏感是PI⁃IBS症状产生的核心机制，肠道内持续存在的低度炎症是使外周神经末梢致敏的重要原因。持续的炎症不仅释放各种炎性介质包括前列腺素、缓激肽、神经生长因子等，还通过刺激EC细胞增生释放5⁃HT，影响胃肠道神经和平滑肌的功能，引起胃肠动力异常和内脏感觉过敏。

图1 各组大鼠海马BDNF的水平Figure 1 Levels of BDNF in hippocampus of rats in each group(±s，n=4)

5⁃HT作为一种具有多种生物功能广泛存在于中枢神经系统和胃肠道的神经递质，被发现积极参与了上述生理病理过程，并与PI⁃IBS患者腹痛、腹泻及内脏敏感等症状密切相关[7]。肠道内5⁃HT的增加，会导致肠神经系统(enteric nervous system，ENS)高度敏感，激活多种神经活性物质，导致脑⁃肠轴内信号异常；而5⁃HT还作用于相关受体，导致患者肠道的感知、运动和分泌改变，产生IBS的症状[8⁃9]。促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是一种能够介导下丘脑⁃垂体⁃肾上腺轴(HPA轴)产生各种应激反应的关键调节肽。应激可以刺激下丘脑的神经内分泌细胞释放CRF，CRF能够激活肥大细胞，使其脱颗粒释放5⁃HT，改变胃肠动力，提高内脏敏感性。因此，CRF可能通过对5⁃HT表达的调控来影响PI⁃IBS的内脏敏感性[10⁃12]。

表4 各组大鼠结肠组织CRF、CGRP、5⁃HT的水平Table 4 Levels of CRF,CGRP and 5⁃HT in colon tissue of rats in each group（±s，n=8）

表4 各组大鼠结肠组织CRF、CGRP、5⁃HT的水平Table 4 Levels of CRF,CGRP and 5⁃HT in colon tissue of rats in each group（±s，n=8）

与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照PI⁃IBS模型TMT广藿香油广藿香水提物剂量/（g·kg-1）--0.1 36 CRF/(ng·mg-1)3.85±0.28 4.89±0.68*3.09±0.26#3.17±0.19##3.15±0.34##5⁃HT/(ng·mg-1)3.22±0.18 4.78±0.36*3.53±0.45#2.85±0.43##2.89±0.51##CGRP/(ng·mg-1)2.51±0.16 4.54±0.25**3.95±0.27*#3.82±0.43*#3.85±0.47*#

TMT是一种胃肠运动节律调节剂，是IBS及其他一些胃肠运动障碍性疾病的常用治疗药物。其可作用于平滑肌细胞膜中的Ca2+、K+通道，对肠道运动产生抑制和兴奋的双重作用。此外，TMT对平滑肌神经受体也有双向调节作用[13]。本实验选用TMT作为治疗PI⁃IBS的对照药物。结果显示，TMT组给药后各项指标均明显优于模型组。结果提示，TMT亦能改善PI⁃IBS大鼠内脏高敏感性。

本实验大鼠结肠运动能力测定结果显示，给药后，TMT组、广藿香油组、广藿香水提物组大鼠2 h内排出粪粒数和结肠MI均显著降低(P＜0.05)，TMT组对结肠运动调节作用优于广藿香油组和广藿香水提物组。给药后，TMT组、广藿香油组、广藿香水提物组大鼠直肠扩张时的疼痛阈值明显上升。广藿香油组、广藿香水提物组对直肠扩张时的疼痛阈值的改善作用优于TMT组。

PI⁃IBS模型组大鼠结肠组织中CRF与5⁃HT表达均显著升高，而5⁃HT的异常升高会导致肠道内脏敏感性和肠道动力异常，证明CRF和5⁃HT的表达异常与PI⁃IBS的发生有密切关系。给予广藿香提取物干预后，广藿香提取物能够明显降低PI⁃IBS模型大鼠结肠内CRF与5⁃HT的含量，说明广藿香可能是通过下调PI⁃IBS模型大鼠结肠CRF的表达，影响肥大细胞释放5⁃HT，降低了结肠内5⁃HT的含量，从而改善PI⁃IBS的相关症状。与TMT组比较，广藿香油组和广藿香挥发油组下调CRF与5⁃HT的作用优于TMT组。

CGRP是一种主要的炎症促进型的感觉神经肽，在结肠固有膜血管壁表达尤其丰富，且在肠壁各层均有分布，具有调节胃肠运动、血流及分泌的功能。作为调节介质和神经递质的CGRP有促炎作用，能直接产生伤害作用，还参与内脏伤害性递质的传递[14]。本研究显示，与模型组比较，广藿香油、广藿香水提物、TMT均可以显著降低PI⁃IBS大鼠结肠CGRP含量，但CGRP水平仍明显高于正常组。结果提示，广藿香提取物和TMT可以通过下调结肠CGRP含量从而调节PI⁃IBS内脏敏感性。

BDNF是神经营养物质家族中的一员，在中枢有致痛和致敏感性作用。研究发现，适量的内源性BDNF可维持感觉神经及其神经通路的正常功能，其异常升高可引起内脏疼痛及其高敏感性[15]。本研究发现，PI⁃IBS模型组大鼠海马BDNF表达明显升高，广藿香干预后可下调模型组大鼠海马BDNF表达，从而改善PI⁃IBS的相关症状。

综上所述，广藿香提取物可以有效调控感染后肠易激综合征的模型大鼠结肠运动，能显著改善大鼠直肠扩张疼痛阈值；广藿香对感染后肠易激综合征模型大鼠内脏高敏感性的调控作用可能与5⁃HT信号系统有关。