基于PI3K/AKT/GSK⁃3β信号通路的杜仲健骨方治疗骨质疏松症作用机制研究

邢威，陈雁雁，王树人，王艳丽，王文姌，张洪财，孙秋

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江护理高等专科学校，黑龙江哈尔滨150301；3.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨150040）

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构退化、骨脆性增加、易骨折为特征的全身性骨骼疾病，重症患者会导致死亡，严重危害人们的身心健康，给社会造成极大的负担[1⁃3]。目前单纯的西药防治骨质疏松症尚存在各种不良反应。中医学有独特的见解，认为肾虚是骨质疏松症发病的重要病机，肾藏精，主骨生髓，以补肾壮骨为主要治法已达成普遍共识[4⁃5]。作者根据临床经验自拟杜仲健骨方，方解：杜仲、淫羊藿补肾壮阳、强筋骨，肾阳推动精血运行，共为君药。补骨脂、怀牛膝均能补肾助阳、强筋骨，以助君药增强疗效，共为臣药。诸药合用，使精血得补，筋骨得健。全方立法周全,组方严谨，共奏补益精血、填髓健骨之功效。

选择2017年1月至2018年6月黑龙江中医药大学附属第一医院骨科的106例骨质疏松症患者为研究对象，比较杜仲健骨方治疗前后相关评分、骨密度和骨代谢指标的变化情况。治疗后，其有效率为89.62%，骨密度值和骨代谢指标均优于治疗前，在临床治疗中取得较好疗效，但该方剂治疗骨质疏松症作用机制尚不清晰。前期研究[6]发现杜仲健骨方作用于Wnt/β⁃catenin信号通路发挥治疗骨质疏松症的作用。

基于上述研究基础，本实验选取信号通路关键蛋白磷酸肌醇3⁃激酶(phosphatidyl⁃inositol 3⁃kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、糖原合成酶激酶⁃3(glycogen synthasekinase 3β，GSK⁃3β)为指标，继续探讨杜仲健骨方治疗骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD清洁级雌性大鼠60只,体质量（180±20）g，生产许可证号:SCXK（黑）2013⁃004，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。

1.2 药材及试剂

杜仲健骨方组成：杜仲、淫羊藿、补骨脂、怀牛膝；药材购自哈药集团哈尔滨世一堂中药饮片有限公司，经黑龙江中医药大学药学院生药学教研室孙慧峰教授鉴定为正品；取饮片杜仲35 g、淫羊藿25 g、补骨脂15 g、怀牛膝15 g，全方水煎煮1 h，煎煮3次，合并提取液，浓缩冻干，出膏率21%。白介素⁃1β（批号：1901205）、肿瘤坏死因子α试剂盒（批号：1903179）（上海酶联生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD，批号：20181024）、丙二醛（MDA，批号：20181216）（上海晶抗生物工程有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（Str ACP）试剂盒（上海钰博生物科技有限公司，批号：201901）；RNA总提取试剂盒（北京百泰克生物科技有限公司，批号：195637）；第一链逆转录试剂盒（天津为科生物科技有限公司，批号：18062）；引物基因合成（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所）；β⁃actin、PI3K、AKT、GSK⁃3β一抗（美国Thermo公司）。

1.3 主要仪器

ME103电子天平（d=1 mg，上海诺科仪器仪表有限公司）；ZX⁃S22数显恒温水浴锅（上海知信实验仪器技术有限公司）；165⁃8001 Western blot电泳槽、垂直电泳系统（美国Thermo公司）；CFX96 RT⁃PCR仪、Varioskan LUX多功能酶标仪（美国Bio⁃Rad公司）；DCS⁃EXV600双能骨密度仪（日本日立公司）；KDC⁃160HR型高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司，半径=10 cm）。

1.4 制备模型、分组及给药

50只大鼠参照文献[7⁃9]方法制备模型，全部动物按照300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉。碘伏消毒后，沿后正中线切开皮肤，于肋弓下脊柱旁开处切开肌肉，打开后腹膜。找到位于肾脏后下方的卵巢，提出并分离周围脂肪组织，结扎双侧卵巢下方的输卵管、血管。切除双侧卵巢，缝合，在每侧手术部位注射青霉素5万u/只,连续3 d。另取10只为空白对照组，按照上述相同方法只翻动两侧卵巢，不作其他处理。术后4周，随机选5只大鼠，取右侧股骨，采用双能X射线骨密度仪进行检测，以验证造模是否成功，经检测模型组造模成功率100%。采用随机数字表法分为杜仲健骨方高（4.86 g/kg）、中（2.43 g/kg）、低剂量组（1.215 g/kg）、阿仑膦酸钠组（阳性药，1 mg/kg）、模型组（生理盐水），每组10只大鼠，造模成功后，开始连续灌胃给药8周。

1.5 骨密度检测

应用骨密度仪测定大鼠股骨的骨密度（BMD），仪器附带软件计算骨密度。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清指标

ELISA测定血清Str ACP、TNF⁃α、IL⁃1β、MDA含量及SOD活性。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT⁃PCR）

检测酸肌醇3⁃激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶⁃3(GSK⁃3β)、磷酸化AKT的第308位酪氨酸[AKT(Thr308)]mRNA表达。

从低温冰箱中（⁃80℃）取出大鼠右下股骨组织100 mg，剪碎，液氮速冻后，反复研磨，按Trizol试剂盒方法提取总RNA，按DNA Eraser试剂盒操作定量后反转录成cDNA，加入引物进行DNA扩增。反应条件：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，70℃退火20 s，72℃延伸1 min，循环40次。在循环反应后，按以下条件测溶解曲线。90℃20 s，50℃1 min，95℃20 s。在50℃升温至95℃过程中，每升高0.5℃采集1次荧光信号，β⁃actin为内参，所用引物均委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。数据采用PCR相对扩增分析方法进行统计，每组重复3次。基因引物见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测骨组织PI3K、AKT、GSK⁃3β蛋白表达

取大鼠肢股骨部分100 mg，用液氮冷冻骨组织并研磨成粉末状，转移至离心管，加入细胞裂解液和磷酸酶抑制剂，充分裂解骨组织，12 000 r/min离心15 min，取上清液总蛋白，测定蛋白浓度并定量，取40μg蛋白进行SDS凝胶电泳，半干法将蛋白转到PVDF膜上，室温条件下脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL显色，曝光，显影，扫描图片，软件测定灰度值，每组重复3次，计算条带吸光度值。

表2 各组大鼠骨密度结果Table 2 Results of bone mineral density of rats in each group（n=10）

1.9 数据分析

使用统计学软件SPSS 18.0分析，实验数据用表示，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度检测结果

见表2。与空白组比较，模型组骨密度明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，杜仲健骨方剂量组、阳性药组骨密度值升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），杜仲健骨方高剂量组与低剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 ELISA测定各组血清指标结果

与 空 白 组 比 较，模 型 组StrACP、TNF⁃α、IL⁃1β、MDA显著升高（P＜0.01），SOD活性显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药组、杜仲健骨方剂量组TNF⁃α含量显著降低、SOD活性显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组、杜仲健骨方中、高剂量组IL⁃1β、StrACP、MDA含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 各组血清TNF⁃α、IL⁃1β、StrACP、SOD、MDA含量结果Table3 ContentsofserumTNF⁃α,IL⁃1β,STRACP,SODandMDAineachgroup（n=10）

2.3 各组对信号通路PI3K/AKT/GSK⁃3βmRNA表达的影响

模型组PI3K、AKTmRNA表达低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组GSK⁃3βmRNA表达高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性药组、杜仲健骨方各剂量组PI3KmRNA表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。阳性药组、杜仲健骨方中、高剂量组AKTmRNA表达高于模型组、GSK⁃3βmRNA低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 各组PI3K、AKT、GSK⁃3βmRNA表达结果Table4ExpressionofPI3K,AKTandGSK⁃3βmRNA（n=10）

表5 各组PI3K、AKT、GSK⁃3β蛋白表达结果Table5 ExpressionofPI3K,AKTandGSK⁃3βprotein（n=10）

2.4 各组对信号通路PI3K/AKT/GSK⁃3β蛋白表达的影响

模型组PI3K、AKT蛋白表达低于空白组，GSK⁃3β蛋白表达高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；阳性药组、杜仲健骨方中、高剂量组PI3K、AKT蛋白表达高于模型组，GSK⁃3β蛋白表达低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

AKT的磷酸化（308位点）[p⁃AKT cThr 308]水平变化显著，与空白组比较，模型组中AKT的磷酸化水平明显降低（P＜0.01），杜仲健骨方组给药后AKT磷酸化水平逐渐升高，呈现出剂量依赖性，与模型组比较，中、高剂量组差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见图1，表5。

图1 骨组织PI3K、AKT、GSK⁃3β蛋白表达Figure 1 Expression of PI3K,AKT and GSK⁃3βprotein in bone tissue

3 讨论

中医学认为骨质疏松症的主要病机为肾精亏虚、肾阳不足，肾虚是其根本原因[10⁃11]。中药治疗疗效明确且副作用较少，受到人们的青睐。本实验结果证实杜仲健骨方能够有效治疗骨质疏松症。TNF⁃α与IL⁃1β具有多种生物效应的细胞炎症因子，研究表明[12⁃13]两者与骨质疏松密切相关，可能通过诱导巨噬细胞集落刺激因子（M⁃CSF）和RANKL的表达刺激破骨细胞形成和骨吸收。本研究发现与模型组比较，杜仲健骨方剂量组中TNF⁃α含量显著降低；杜仲健骨方中、高剂量组中IL⁃1β含量显著降低，说明该方剂可减轻骨质疏松的炎症反应，并且呈剂量依赖性。SOD与MDA是反映机体自由基的清除能力及氧化应激的损伤程度的重要指标，氧化应激抑制Wnt通路可激活Fox O通路，引起骨质疏松的发生发展[14]。本研究发现与模型组比较，杜仲健骨方剂量组中SOD活性显著升高，杜仲健骨方中、高剂量组MDA含量显著降低，说明该方剂可明显减轻氧化应激损伤，并且呈剂量依赖性。Str ACP主要存在于破骨细胞中，其血清含量的高低可反映破骨细胞骨吸收的活跃程度。与模型组比较，杜仲健骨方中、高剂量组Str ACP含量显著降低。表明该方剂能够抑制骨吸收。

杜仲健骨方通过促骨形成的作用治疗骨质疏松症，这种成骨作用是否与促进细胞增殖有关尚不明确。PI3K/Akt信号通路是细胞增殖、转移、黏附和死亡过程的重要调节者。在正常生理条件下，PI3K/Akt信号通路可选择性地影响成骨细胞和破骨细胞的生理功能，对维持骨组织动态平衡具有重要作用[15⁃16]。PI3K激活后，作为PI3K下游的靶点蛋白，可以使磷肌醇类因子发生磷酸化，特别是磷酸化AKT的第308位酪氨酸从而激活AKT，是其该蛋白质活性的调节枢纽[17]。GSK⁃3β能够被多种信号通路调节，影响细胞存活，PI3K/Akt是其中最重要的上游调节通路[18⁃23]。AKT可使GSK⁃3β第9位丝氨酸磷酸化，降低GSK⁃3β的磷酸化水平，从而诱导细胞凋亡。本研究发现，杜仲健骨方能够上调PI3K的表达水平和AKT的磷酸化水平，并且下调GSK⁃3β的表达水平，说明该方剂可以调控PI3K/AKT/GSK⁃3β信号通路。杜仲健骨方治疗骨质疏松症的作用机制，可能与调控PI3K/AKT/GSK⁃3β信号通路有关，具体作用机制还需深入研究。