变性乳清分离蛋白胶体及其在慢速团聚条件下团聚动力学的光散射研究

魏丹，蒋赣，伍春娴

（广东药科大学医药化工学院，广东中山528458）

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）被称为“蛋白之王”，是从牛奶中提取的一种蛋白质，具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，其生物学价值和临床价值较高，在食品、医疗等领域具有重要的意义和广阔的应用前景[1⁃3]。因此，近年来许多专家学者开展了对WPI的研究，尤其是对其团聚和凝胶行为及相应团聚体和凝胶结构的研究[4⁃5]。

过去，WPI用于食物和医药领域的时候，都是首先将WPI加入到食物或者药物中，然后将混合物加热到至少65℃形成浓度较高的溶液或凝胶[5⁃7]，这样很容易破坏食物和药物的性质。于是冷固团聚和凝胶技术应运而生，这种技术将WPI加入到食物和药物中的方法分为两步：第一步将WPI热变性得到WPI初 级 团 聚 体（WPI⁃PreA，Why Protein Isolate Pre⁃aggregate）胶体分散体；第二步再将WPI⁃PreA胶体分散体和食物或药物一起在室温下用电解质（Ca⁃Cl2，NaCl等）诱导团聚和凝胶[8⁃9]。目前，文献报道的大多数研究集中于第一步，两步结合起来研究以及对第二步团聚过程的动力学研究比较少。本研究采用光散射方法将两步研究结合起来，第一步对WPI热 变 性 得 到WPI⁃PreA，用 广 角 光 散 射 仪（WALS，Wide Angle Light Scattering）的动态光散射（DLS，Dynamic Light Scattering）和 静 态 光 散 射（SLS，Static Light Scattering）方法测量WPI⁃PreA的一系列重要参数；第二步采用电解质CaCl2溶液对WPI⁃PreA诱导团聚，首先得到其临界聚沉浓度（C CC，Critical Coagulation Concentration），然后选取远离C CC的1个CaCl2溶液浓度，用小角光散射仪（SALS，Small Angle Light Scattering）研究其在慢速团聚（RLCA，Reaction Limited Cluster Aggregation）条件下的团动力学和团聚体结构，同时引入了电子显微镜（EM，Electron Microscopy）的取像成像显微技术验证得到的团聚体结构的可靠性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

针头式过滤器（25 mm GD/X，滤纸孔径0.45 mm，英国Whatman公司）；电子显微镜（FEI Quanta 600 ESEM，美国），检测系统：取向成像显微术（OIM），EDX能谱分析，特点：LaB6发射极，高压1～40 kV；广角光散射仪，BI⁃200SM角度测量器（美国Brookhaven Instruments）配以Ventus LP532型激光发射器（英国Laser Quantum），入射光波长为λ1=532 nm，测角范围20～145°；Mastersizer 2000小角光散射仪（英国Malvern），入射光波长为λ2=633 nm，测角范围0.02～40°。

1.2 试剂

WPI粉末（BiPro，JE345⁃3⁃420，Davisco Foods In⁃ternational Inc.，美国明尼苏达）；叠氮化钠（NaN3，分析纯）、NaOH（固体，分析纯）、HCl溶液（0.1 mol/L，分析纯）、4⁃羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液（HEPES，分析纯）均由Sigma⁃Aldrich公司提供。超纯水，自制。

2 方法

2.1 WPI⁃PreA的制备及性质测定

将WPI粉末溶解于超纯水（后面所有溶液的配置均用超纯水）中，并用NaOH或HCl溶液调节pH值至7.0左右，配制成WPI浓度Cp=100 g/L的溶液后加热到90℃保持30 min使全部变性，然后趁热用针头式过滤器将溶液过滤除掉溶液中可能存在的大团聚体。变性后得到的WPI⁃PreA溶液进一步用含有NaN3（作用是避免细菌滋生）的超纯水稀释至Cp=50 g/L的胶体分散体（最终NaN3的浓度为5×10-3mol/L），储存于温度为4℃左右的冰箱中，备用。按照文献[10]方法采用DLS和SLS方法测量初级粒子在不同浓度的旋转半径R g,0和Rh,0。

2.2 临界聚沉浓度的测量

临界聚沉浓度（C C C，Critical Coagulant Concen⁃tration）是指在一定时间内，使一定量的溶胶发生明显的聚沉所需电解质的最小浓度。将一定数量的分散体滴加到不同浓度的电解质溶液中，设定胶粒的体积分数为φ=5×10-2时，肉眼观察是否有絮状凝胶物出现，絮状凝聚物马上出现时电解质的最小浓度即为该胶体的临界聚沉值。需要说明的是，虽然以上测试聚沉值的方法为经验方法，但因为胶体的稳定性对离子的强度变化极其敏感，特别是胶粒与分散介质的颜色差别较大时，聚沉值的误差在10%以下[8,11]。测得本体系WPI⁃PreA在CaCl2诱导下的C CC值为26 mmol/L。

2.3 CaCl2诱导的RLCA团聚实验及测量

为了保证团聚实验在RLCA条件下进行，选取远离C C C的CaCl2浓度Cs=10 mmol/L，胶粒体积浓度C p=2.00 g/L。实验开始前，先用超纯水对WPI⁃PreA胶体分散体和CaCl2溶液进行多次稀释，以免胶体溶液和电解质溶液浓度太高导致团聚实验过程中局部混合不均而出现大团聚体。然后把稀释的CaCl2溶液倒入胶体分散体中达到设定的电解质浓度、胶粒浓度和设定的pH值7.00。平衡几秒后，将溶液分成相等的两部分，一部分用注射器迅速但轻轻地把团聚体系注入SALS测试槽，在线检测胶粒的团聚动力学过程；另一部分置于与测试槽温度相同的恒温水槽中，待到团聚实验结束时取出团聚体做EM测试。

3 结果与讨论

3.1 WPI⁃PreA表征结果

由Zimm⁃plot[12]方法可知胶粒的重均分子量Mw和第二维里系数A存在如下关系：

其中,Cp是WPI的浓度，g/cm3；K是光学常数:

其中，n0是溶剂水的折光指数（1.33）；d n/d C p是WPI溶液的折光指数增量，根据文献[13]及WPI成分组成计算值为0.190 cm3/g；N A是阿伏伽德罗常数（6.02×1023）；方程(1)中的R e x(θ)是胶粒在角度θ的超瑞利比，它与相同角度下甲苯的超瑞利比R T（Wu等测得在入射光波长范围为420～700 nm时，其值为2.13×10-5cm-1）之间的关系为：

其中，Iex(θ)是所测胶体在角度θ的光散射强度；IT是甲苯在与所测胶体相同测试条件下的光散射强度，nT是甲苯的折光指数，取1.496。

图1中的圆点曲线是用SLS方法得到的K Cp/Rex(0)与WPI浓度Cp之间的关系，二者基本呈直线关系，用方程(1)由直线斜率和截距可以得到WPI⁃PreA的重均分子量Mw和第二维里系数A2的值，见表1。可见，A2的值是正值，表明WPI⁃PreA之间的相互作用力是排斥力，这与蛋白质表面含有羧基有关，其pKa～4.75，本体系pH为7.00，羧基基本处于电离状态带负电，分子与分子之间的羧基间存在排斥力，因此，置于冰箱中并且含有5×10-3mol/L的NaN3的WPI⁃PreA可以保存数月之久。WPI的分子量为6.06×104g/mol，从Mw值可以算出WPI⁃PreA的聚集度Nagg为91.82，见表1。

用SLS和DLS方法测得的不同C p下WPI⁃PreA的旋转半径Rg,0和水力学半径Rh,0见图1所示。可见，Rh,0的平均值为29.32 nm，与C p基本无关，而R g,0的平均值为70.54 nm，是Rh,0的2.50倍，且其值随Cp的增加有些许减小。这主要是由R g,0和Rh,0的定义及初级团聚体的结构决定的，Rg,0是根据胶粒分子上各个点到其质量中心的平均距离计算的，而Rh,0是指与所测胶粒具有相同扩散系数的球形胶粒的半径，所以Rg,0与胶粒形状密切相关，其值随Cp减小，说明其外部无规则延展开的链因为浓度增加导致胶粒之间相互碰撞几率增加而受到阻碍，Rg,0的平均值为Rh,0的2.50倍主要也是由于WPI变性时形成的延展开的长纤维状结构所致[14⁃15]。

表1 初级团聚体WPI⁃PreA相关参数的测定结果Table 1 Parameters of the prepared WPI pre⁃aggregates(WPI⁃PreA)

图1 KCp/R ex(0)、WPI⁃PreA旋转半径R g,0和水力学半径Rh,0与WPI浓度C p的关系Figure 1 The relationship between the quantity,KC p/R ex(0),the radius of gyration,R g,0,and the hydrodynamic radius,R h,0,of the WPI⁃PreA,and the WPI concentration,Cp

3.2 RLCA条件下WPI⁃Pre A的团聚动力学和团聚体结构

WPI⁃Pr e A的团聚在室温下进行，浓度固定在C p=2.00 g/L。SALA所测得的团聚体的光散射强度I(q)的表达式如下[10,16]：

其中，I(0)是q=0的散射强度，P(q)是初级团聚体WPI⁃Pre A的形状因子，它由直接测量浓度为2.00 g/L的WPI⁃Pr e A分散体得到，〈S(q)〉是电解质诱导团聚得到的团聚体的归一化形状因子，对初级团聚体可以认为〈S(q)〉=1。q是基于散射角q计算得到的波矢量：

团聚体的平均旋转半径〈R g〉*和分形维数D f，可以从〈S(q)〉得到[10,17]：

由方程(6)和(7)得到的平均旋转半径只有在团聚体足够大时才正确，对小团聚体，比如在团聚初始阶段生成的团聚体，初级团聚体对旋转半径的贡献需要考虑进来：

其中，R g,0的值见表1所示。

此外，分形维数Df还可以由q=0处的光散射强度I(0)求得[8,18]：

胶粒团聚过程中团聚体质量分布可以用PBE模型来表述[8,15,18]：

其中N i(t)是质量为i的团聚体在时间t的质量浓度，K i,j是质量为i和j的两个团聚体之间的团聚速率常数，它的定义如下：

其中，KB=8kT/3μ是Smoluchoeski速率常数（k是波尔兹曼常数，1.381×10-23J/K，T和μ分别是分散体的温度和动力学黏度，单位分别为K和Pa·s）；W是Fuchs稳定性常数，典型RLCA团聚过程其值大于5，一般小角光散射适合测得的值在103～107数量级的范围；乘积项(ij)λ表示在RLCA团聚过程中，团聚体的反应速率随团聚体质量的增加而增大，指数λ的值理论上一般是0.50左右[10,15,19⁃20]。这个模型的解能给出整个团聚过程中不断长大的所有团聚体的质量分布（Ni，i=1,2，……），从Ni可以计算出团聚体的平均旋转半径〈R g〉的值：

其中，Rg,i是质量为i的单个团聚体的旋转半径，RLCA条件下，无融合胶粒团聚体的分形维数D f值的范围为2.00～2.10，可以通过上述团聚体平均结构因子〈S(q)〉和q=0处光散射强度I(0)等得到，可以作为一个已知参数，所以通过公式(10)、(11)和(12)拟合胶粒的团聚动力学就只有W和λ两个拟合参数，尽管体系中有两个拟合参数，但W只对〈R g〉的初始值敏感，而λ对团聚过程后期的〈Rg〉值敏感。

图2是用SALS测得的团聚体的散射强度随时间的演化曲线，分为两个不同的时间间隔展示于(A)（团聚初期）和(B)图（团聚中后期），从图(A)可以看到早期的团聚时间t=20.60 min时，I(q)的值在大q值处（q=1×10-3）有一个弯曲，其弯曲位置随着时间不断上扬且移向小q值处（q＜1×10-3），在q＞1×10-3部分曲线不重叠，说明团聚初期是由WPI⁃PreA初级团聚体或微观结构团聚体不断结合长大的过程。团聚中后期图(B)中I(q)的值在q＜1×10-3部分依然随着时间向上增长，而在q＞1×10-3部分，曲线重叠在一起基本与时间无关，这表明微观结构的变化已经结束，这些微观结构团聚体开始连接在一起形成宏观结构，即凝胶。I(q)的值随着团聚过程的进行显著增大，表明团聚体随着团聚的进行逐渐长大，这种缓慢、渐进的团聚体增长表明WPI⁃PreA的团聚是在RLCA条件下进行的，I(q)曲线上的幂指数区域跨越两个数量级且其斜率值为-2.10，是典型的RLCA条件下得到的团聚体的分形维数的值。

图2 WPI⁃PreA团聚过程中的团聚体的光散射强度I(q)曲线随时间的演化曲线Figure 2 Typical time evolution of the scattered intensity curves I(q)to the aggregation of the WPI⁃PreA

将不同时间团聚体的归一化平均结构因子〈S(q)〉对归一化的波矢量q×〈R g〉作图，如图3所示，可以看到曲线全部重叠在一起，幂指数区域跨越两个数量级，呈直线关系，直线的斜率为-2.10，说明WPI⁃PreA的团聚体的结构表现出分形体特征，且在研究条件下的团聚过程属于典型的RLCA团聚，分形维数D f=2.10。为了更进一步证明从I(q)和S(q)得到的Df值的正确性，用公式(9)计算了不同时间q=0处的散射光强度I(0)与〈R g〉/Rh,0之间关系，如图4所示，可见除了团聚初始阶段的两个点（团聚初期会有稍许误差），I(0)与〈R g〉/Rh,0的log⁃log对数关系图基本呈直线，且直线斜率为2.11，进一步证明了WPI⁃PreA在RLCA条件下的团聚过程中形成团聚体的Df值确实是2.10左右。分形维数D f越小，所形成团聚体的结构越疏松；反之，Df值越大，如D f的值为3.00左右，说明形成团聚体的结构越紧密，纤维状凝胶与含有低分形维数的团聚体的凝胶是相似的，根据所得到的D f的值认为团聚体的结构呈纤维状结构[10]。取上述方法得到的Df=2.10，将W和入作为拟合参数，用PBE模型方程(10)、(11)和(12)对采用公式(6)和(8)计算得到的团聚体的平均旋转半径〈Rg〉随时间t的变化曲线进行拟合，得到W和λ的值分别为1.10×106和0.45，如图5所示，可见曲线拟合值和空心圆点实验值能较好地吻合，证明了前面得到的D f值的可靠性。

图3 图2中不同时间的团聚体的归一化平均结构因子〈S(q)〉与归一化的波矢量q×〈Rg〉的函数关系图Fi gure 3 The normalized average structure factor of clusters,〈S(q)〉,at various aggregation times,as a function of normalized wavevector,q×〈R g〉corresponding to the ag⁃gregation system in Fig.2

为了更进一步验证对团聚体结构分析的可靠性，采用电镜（EM）的取像成像技术对团聚实验结束时的团聚体进行分析，结果见图6。可见，团聚体呈绞成股状的疏松的纤维状结构，验证了光散射实验结果的可靠性。

图4 在q=0处的散射光强度I(0)与〈R g〉/Rh,0之间关系的时间演化曲线Figur e 4 Time evolution of the intensity at q=0,I(0),as a function of the corresponding〈R g〉/Rh,0

图5 〈Rg〉随时间t的变化规律的PBE拟合结果（实线曲线）与实验结果（空点点线）的比较Figur e 5 PBE simulations(solid line)of the time evolutions of〈Rg〉compared with experiments(open symbol)

图6 WPI⁃PreA团聚体的EM图Fi gure 6 EM image of WPI⁃PreA clusters

4 结论

本文采用光散射方法研究乳清分离蛋白WPI热变性得到的初级团聚体WPI⁃Pre的性质及WPI⁃Pre在电解质CaCl2诱导下在慢速团聚（RLCA）下的团聚动力学和团聚体结构。得到的WPI⁃Pre的一系列重要参数：重均分子量Mw、第二维里系数A2、旋转半径Rg,0和水力学半径Rh,0的值，说明初级胶粒分子之间存在排斥力且呈纤维状结构，这种分析方法能为蛋白质的分析检测提供一种比较可靠的方法。通过小角光散射研究分析认为团聚体呈疏松的纤维状结构，电子显微镜的取像成像显微术验证了光散射测试结果的可靠性，对团聚体结构的表征能为未来多孔材料、药物缓释胶囊等材料的制备提供参考依据和指导。