MP-SAT作为支原体肺炎患儿疗效监测指标的可行性分析

司徒宝珠

惠州市中医医院(惠州 516000)

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是介于细菌与病毒之间的兼性厌氧微生物[1]，其引起的肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)约占非细菌性肺炎的30%，约占儿童社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的20%[2]。MPP病情较轻，一般表现为发热、咳嗽、乏力等，对大环内酯类抗生素效果好。但近年来MP感染所致的大叶性肺炎(croupous pneumonia)逐渐增多，且MP耐药率随着抗菌药物的不合理应用不断升高，导致部分病例治疗棘手[3]。因此，探索一种有效方法对MPP患儿疗效实时监测具有重要的临床意义。目前，临床最常用的诊断MP感染方法为血清MP抗体(MP-Ab)检测，但其阳性率易受患儿机体免疫状态、年龄、病程等因素干扰，无法准确反映药物疗效和预后[4]。国外相关研究报道[5]，具有无创性、操作简单和快速等特点的RNA实时荧光恒温扩增技术(SAT)可直接以肺炎支原体RNA为靶标进行恒温扩增检测，已成功应用于肠道轮状病毒(rotavirus，RV)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)、泌尿生殖道沙眼衣原体(C.trachomatis)等病原的检测，然而SAT应用于MPP患儿检测尚未见报道。故本研究将肺炎支原体RNA实时荧光恒温扩增技术(MP-SAT)应用于MPP患儿治疗效果的监测，旨在探讨该方法的可行性和应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

经我院医学伦理委员会批准，选择2017年10月—2018年10月我院儿科收治的因CAP住院的患儿178例作为研究对象，将其分为MPP组(n=80例)与非MPP组(n=98例)。纳入标准：①符合《实用儿科学》第7版和“儿童社区获得性肺炎管理指南(2013年修订版)中MPP诊断标准[3]；②肝、肾功能正常；③近2个月内无肠道及上呼吸道感染；④均取得患儿家长的知情同意；⑤心电图正常。排除标准：①合并风湿性疾病或肺结核；②免疫功能低下；③首次MP-SAT阳性但未行复测的患儿；④病例资料不完整。MPP组：男患儿43例，女患儿37例，年龄(5.83±2.68)岁，体质量指数(body mass index，BMI)为(13.27±6.21)kg·m- 2；非MPP组：包括细菌性肺炎32例，百日咳10例、病毒性肺炎52例，细菌和病毒混合感染肺炎4例；男患儿47例，女患儿51例，年龄(5.97±2.34)岁，BMI为(13.09±6.75)kg·m- 2。两组患儿年龄、性别、BMI等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

①MP-Ab滴度测定：采集所有患儿入院当日外周静脉血4 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清后采用颗粒凝集法检测MP抗体，MP-Ab滴度≥1:160判读为阳性。②MP-SAT检测：医用棉签(深圳市科林姆科技有限公司)取咽部分泌物，将拭子头置于1 mL生理盐水(珠海市司迈科技有限公司)浸泡贴管壁挤干，取500 μL生理盐水加入至1.5 mL离心管(北京研勤科技有限公司)中，再加入500 μL裂解液(北京伯迈科技有限公司)，震荡混匀，应用MP-SAT试剂盒(海仁度生物科技有限公司)提取待测样本RNA，后转至荧光定量PCR仪(上海罗氏诊断产品有限公司)扩增。反应程序：荧光通道设定为FAM，42 ℃ 1分钟为一个循环，共40循环；荧光信号1分钟采集1 次，共采集40次；从40 ℃～80 ℃行溶解曲线分析，样本曲线与阈值曲线交叉点的横坐标读数(监测时间)为dt，dt>40 min为阴性，dt≤35 min为阳性。③MPP治疗方案：给予10 mg·kg-1注射用阿奇霉素(海南海灵化学制药有限公司，国药准字H20020254)静脉滴注，1次/d，连续治疗28 d。

1.3 评价项目

①统计分析178例CAP患儿MP-SAT和MP-Ab检测结果；②分析MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性；③MP-SAT与MP-Ab在患儿不同治疗时间点(入院后<24 h、7 d、21 d、28 d时)的检出率；④MP-SAT转阴时间与临床痊愈时间的相关性。临床痊愈标准：发热、咳嗽等临床症状消失，胸部X线好转，实验室指标[白细胞(white blood cell，WBC)计数、淋巴细胞(lymphocyte)百分比、中性粒细胞(neutrophils)百分比、超敏C反应蛋白(High sensitive C reactive protein，hs-CRP)水平、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平]检查结果恢复正常；⑤MP-SAT转阴时间与MPP患儿临床症状、实验室指标及X线胸片的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料比较采用卡方检验，计量资料比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 178例CAP患儿MP-SAT和MP-Ab检测结果

MPP组仅有MP-Ab阳性23例(28.75%)，仅有MP-SAT阳性25例(31.25%)，MP-SAT、MP-Ab均为阴性4例(5.00%)，MP-SAT、MP-Ab均为阳性28例(35.00%)，MPP组MP-SAT、MP-Ab结果不一致的比例为60.00% (48/80)。非MPP组仅有MP-Ab阳性17例(28.75%)，仅有MP-SAT阳性2例(31.25%)，MP-SAT、MP-Ab均为阴性79例(5.00%)，MP-SAT、MP-Ab均为阳性0例(35.00%)，非MPP组MP-SAT、MP-Ab结果不一致的比例为19.39%(19/98)，见表1。

表1 178例CAP患儿MP-SAT和MP-Ab检测结果(例)

2.2 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性分析

MP-SAT诊断MPP的敏感性略高于MP-Ab，无差异(P>0.05)；MP-SAT诊断MPP的特异性高于MP-Ab，有差异(P<0.05)；MP-SAT诊断MPP的阳性预测值高于MP-Ab，有差异(P<0.05)；MP-SAT诊断MPP的阴性预测值略高于MP-Ab，无差异(P>0.05)，见表2。

表2 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性分析

2.3 MP-SAT和MP-Ab在不同治疗时间点MP检出率

见表2，MP-SAT和MP-Ab同时阳性28例。MP-SAT检出率随治疗时间的延长降低(P<0.05)；MP-Ab检出率随治疗时间的延长升高(P<0.05)；14 d时MP-SAT与MP-Ab检出率比较，无差异(P>0.05)；<24 h、7 d、21 d、28 d时MP-SAT与MP-Ab检出率比较，有差异(P<0.05)，见表3。

表3 MP-SAT和MP-Ab在不同治疗时间点MP检出率 n(%)

2.4 MP-SAT转阴时间与临床痊愈时间的相关性

28例MP-SAT和MP-Ab同时阳性的病例临床痊愈时间为(3.11±0.88)周，MP-SAT转阴时间为(3.25±0.74)周，无差异(P>0.05)，见图1。

图1 MP-SAT临床痊愈时间与转阴时间比较

2.5 MP-SAT转阴时间与MPP患儿临床症状、实验室指标及X线胸片的相关性

MP-SAT转阴时间越长的病例表现为发热持续时间越长，X线胸片肺大片实变比例越高，CRP水平越高，LDH水平越高，中性粒细胞百分比越高，淋巴细胞百分比越低，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d五个MP-SAT转阴时间点间差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 MP-SAT转阴时间与MPP患儿临床症状、实验室指标及X线胸片的相关性

3 讨 论

MPP是由MP引起的肺部急性炎症，也是5岁以下儿童死亡的首位病因。Wang L等[6]认为与患者对病原体或其代谢产物的过敏反应有关。MPP起病较缓慢，潜伏期15～20 d，病初多表现为发热、头痛、食欲不振、阵发性刺激性呛咳等，后期咳嗽伴有黄色粘痰及少量血丝，严重者可造成凝血功能紊乱及神经系统、皮肤黏膜、胃肠道损害[7- 8]。既往临床资料显示[9-10]，早期适当应用大环内酯类抗生素可减轻症状及缩短病程，但MP感染人体后症状不典型，使部分MPP诊断不明确，导致抗生素的不合理应用，从而使大部分抗生素的耐药率居高不下，给支原体肺炎早期诊断及后期治疗带来困难。因此，寻找一种操作简便、快速直接的方法检测MPP治疗效果有益于提升患儿预后。MP-SAT是新一代RNA活菌检测技术，是在RNA-SAT和实时荧光检测技术基础上建立的，具有无创性、窗口期短、操作简单、快速准确的特点，能即时反映MP感染情况，可辅助MPP早期诊断及疗效观察，且儿童依从性相比需有创操作的MP-Ab更好，故近年来已成功应用于肠道RV、泌尿生殖道C.trachomatis、MTB等病原的检测[11]。MP-SAT阳性可提示MP近期感染，而不是既往感染，其原因在于RNA仅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，而该方法可快速区分“死菌”和“活菌”[12]。本研究选取临床诊断为CAP的178例患儿为研究对象，包括80例MPP，其中MP-SAT、MP-Ab均为阴性4例(5.00%)，可能入院前有阿奇霉素治疗史；98例非MPP，其中MP-Ab(+)17例，RNA-SAT(+)2例，其抗体滴度均<1:160。分析MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性发现，MP-SAT检测的敏感度和特异度分别为65.00%(52/80)、97.96%(96/98)，提示MP-SAT具有较好的诊断价值，阴性可排除MP感染，同时MP被杀灭后RNA快速降解，提示其可用于MPP疗效监测。Li W等[13]报道以荧光定量PCR为参照，MP-SAT的敏感度(83.45%)明显高于本研究(65.00%)，而特异度(98.33%)与本研究(97.96%)相近。分析其原因，认为可能与定量PCR产生的假阴性有关。Ying D等[14]研究RNA-SAT诊断MP感染的敏感度和特异度分别为72.96%和95.69%。造成不同研究MP-SAT检测敏感度和特异度不同的原因主要是对非MPP真阴性和MPP真阳性纳入标准不同，本研究纳入标准均以患儿出院后最终综合临床表现、实验室检查、影像学检查为准，最大限度排除了假阳性和假阴性，所得结果更为可靠。此外，本研究还显示了MPP组MP-SAT、MP-Ab结果不一致的比例为60.00% (48/80)，非MPP组MP-SAT、MP-Ab结果不一致的比例为19.39%(19/98)，提示MP-SAT、MP-Ab在MPP诊断中的一致性较差。

随后，本研究分析了MP-SAT和MP-Ab在不同观察时点MP检出率，发现MP-SAT阳性率随治疗时间延长显著降低，而MP-Ab阳性率随治疗疗程延长其滴度反而持续升高，在入院后<24 h、7 d时的阳性率较低(分别为57.14%、64.29%)，在14 d、21 d、28 d时其阳性率显著升高(分别为96.43%、100%、100%)。目前，抗生素停药主要依据临床症状、体征、炎性指标恢复正常，对临床痊愈有一定提示意义，但仍缺乏客观的停药指征。本研究结果显示，28例MP-SAT和MP-Ab同时阳性的病例临床痊愈时间为(3.11±0.88)周，MP-SAT转阴时间为(3.25±0.74)周，提示临床痊愈时间与MP-SAT转阴时间无相关性，说明MP-SAT动态变化可为疗效监测提供依据。有研究认为[15]MP-SAT转阴时间长可能与体内存在较强的免疫炎症反应有关。为此，本研究还探讨了MP-SAT转阴时间与MPP患儿临床症状、实验室指标及X线胸片的相关性，结果显示MP-SAT转阴时间越长的病例表现为发热持续时间越长，X线胸片肺大片实变比例越高，CRP水平越高，LDH水平越高，中性粒细胞百分比越高，淋巴细胞百分比越低，提示MP-SAT转阴时间与MPP患儿临床症状、实验室指标及X线胸片有相关性。我们猜测这种结果可能与MP感染后免疫抑制有关，淋巴细胞百分比越低者可能对肺炎支原体更易感，提示针对发热持续时间长、X线胸片肺大片实变比例高、CRP及LDH水平高、中性粒细胞百分比高、淋巴细胞百分比低者，适当延长其疗程可能会减轻相关临床症状，改善MPP患儿预后。

综上，MP-SAT作为新一代RNA活菌检测技术在支原体肺炎患儿疗效监测中有较高的价值，值得推广。