幽门螺杆菌抗菌药物耐药分子机制的研究进展

侯 宠 刘一品

滨州医学院烟台附属医院消化内科(264100)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种革兰阴性微需氧螺旋杆状细菌，感染性强，可特异性定植于胃黏膜表面，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤、胃癌等上消化道疾病密切相关[1]。Maastricht Ⅴ/Florence共识已将Hp根除治疗的范围扩展至无症状感染者[2]。目前针对Hp的根除治疗主要包括围绕抗菌药物为主的标准三联疗法(质子泵抑制剂+两种抗菌药物)和铋剂四联疗法(质子泵抑制剂+铋剂+两种抗菌药物)。目前，Hp在全球的感染率已过半。在我国，由于抗菌药物滥用等一系列原因，Hp感染率已超过世界平均水平，临床上对抗菌药物的耐药菌株越来越多见[3]。甲硝唑、克拉霉素以及左氧氟沙星的耐药率分别已高达40%～70%、20%～50%以及20%～50%，且存在明显的地域差异，双重、三重、四重耐药率逐年上升[4]。因此，解决抗菌药物耐药的问题已成为成功根除Hp的关键。本文就Hp抗菌药物耐药分子机制的研究进展作一综述。

一、Hp的抗菌药物耐药机制

目前，用于根除Hp的抗菌药物主要包括大环内酯类(如克拉霉素)、硝基咪唑类(如甲硝唑)、氟喹诺酮类(如左氧氟沙星)、阿莫西林、呋喃唑酮、四环素以及利福平。部分抗菌抗物可阻断细菌核酸的合成如甲硝唑、利福平、左氧氟沙星；部分可阻断细菌核糖体的合成如克拉霉素、四环素；部分可影响细菌细胞壁的合成如阿莫西林[5]。而抗菌靶基因发生突变、细胞屏障或外排系统发生改变、细菌球形变、诱导自噬以及与耐药相关的酶或毒力因子的分泌等一系列原因均可使细菌逃避抗菌药物的活性而导致细菌耐药。

1.靶基因发生突变

①DNA促旋酶基因突变：DNA促旋酶属细菌裂解酶，维持着细胞内正常的DNA螺旋结构，与DNA复制、转录、重组以及修复密切相关。有研究[6]表明，氟喹诺酮类药物是有效的DNA促旋酶抑制剂，可导致不可逆性的细菌DNA损伤。DNA促旋酶基因由GyrA和GyrB两个亚基构成，Hp DNA促旋酶基因突变，尤其是GyrA基因突变，可阻止氟喹诺酮类药物与酶特异性结合，从而导致细菌耐药。GyrB突变亦可导致Hp对氟喹诺酮类药物耐药，但通常与GyrA突变同时存在。GyrA耐药决定区最常见的点突变为第87和第91位密码子的突变[7]，其中第87位突变可能与Hp对氟喹诺酮类药物高水平耐药相关。此外，GyrA基因中第88和97位密码子的突变、新发现的GyrA突变位点(如A129T、R140K、D192N、D34N、D161N、D34Y、R140K)以及GyrB基因突变(如D484K、F438S)均与氟喹诺酮耐药密切相关[8-9]。

②RNA聚合酶基因突变：RNA聚合酶是一种由多个蛋白质亚基组成的复合酶，以Hp DNA为模板，与RNA转录密切相关。RNA聚合酶基因突变使RNA聚合酶上的抗菌药物靶位发生构象改变，抗菌药物无法与酶特异性结合，从而丧失抗菌作用。RNA聚合酶Pro基因编码的B亚基突变是导致Hp对利福平耐药的主要原因。目前发现第526～545、585、586、701以及149位密码子突变均可使Hp对利福平耐药，其中第526～545位突变起主导作用[10]。

③氧化还原酶编码基因突变：氧化还原酶作为生物体内氧化还原体系中重要的催化酶，通过传递电子等一系列反应，在细菌的生长发育中发挥重要作用。部分抗菌药物如甲硝唑，可从氧化还原反应中抢夺电子而发挥其抗菌活性，而氧化还原酶相关基因突变中断了这一过程，使Hp逃避了抗菌药物活性导致耐药。在Hp中，氧化还原酶编码基因主要包括rdxA、frxA以及fdxB[11]。rdxA编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)亚硝基还原酶，frxA编码NADPH黄素氧化还原酶，fdxB编码类铁氧体蛋白。其中rdxA基因突变是引起Hp对甲硝唑耐药的主要原因，该基因突变使NADPH亚硝基还原酶活性降低，导致还原硝基的能力下降，不能取得足够低的氧化还原电位，使甲硝唑无法还原生成具备杀菌活性的代谢产物[12]。然而相关研究[13]显示，仅存在rdxA基因突变似乎不足以引起甲硝唑耐药，可能需要其他因素协同作用。此外，有研究[14]发现frxA基因可增强rdxA突变株的耐药性。

④核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)编码基因突变：rRNA是生物细胞中主要的核糖核酸之一，是一种具有催化能力的核糖酶，是参与生物体内蛋白质合成的重要结构。Hp作为一种原核生物，其rRNA分为5S rRNA、16S rRNA以及23S rRNA，Hp的耐药性与16S rRNA和23S rRNA编码基因突变有关。大环内酯类药物的抗Hp机制是其与23S rRNA的Ⅴ结构域中的肽基转移酶环可逆性结合，从而阻止肽链的延伸。而细菌23S rRNA编码基因Ⅴ区的点突变会使核糖体构象改变，使抗菌药物与核糖体的亲和力减弱，核糖体内肽链得以延伸，细菌可完成蛋白质合成工作而抗菌药物无法发挥完全的抗菌作用[15]。目前最常见的3个V区点突变为A2143G、A2142G以及A2142C[16]。多项研究[17-18]发现A2146C、A2146G、A2147G等一些新的突变位点与克拉霉素耐药相关。同样，16S rRNA编码基因初始结合位点点突变可导致四环素耐药，其主要的突变位点位于926～928位，AGA～TTC的三碱基发生变化[19]。此外，抗菌药物耐药水平与这3个碱基的突变数量有关，碱基替换数量越多，耐药性越高[11,20]。

⑤细菌青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)编码基因突变：PBPs是存在于细菌表面的一类膜蛋白，参与Hp细胞壁中肽聚糖的合成，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用。通常情况下，阿莫西林与PBPs中的多溴联苯共价结合，阻断肽聚糖的合成，细菌细胞壁发生缺陷使细菌失去保护屏障而膨胀、破裂，从而发挥阿莫西林的抗菌作用。PBPs编码基因突变使阿莫西林与PBPs的亲和力减弱而发生耐药。目前已鉴定出4种PBPs，分别为PBP1、PBP2、PBP3以及PBP4。其中PBP1A基因点突变是阿莫西林耐药的主要机制[21]，这些点突变主要位于PBPs 3个结构域中的两个区域中，分别是保守的残基402～404和555～557，突变位点包括A369T、S414R、N562Y、D535N、S543R等[22-24]。此外，在PBP1突变的基础上，PBP2和PBP3突变可发挥更强大的耐药性[25]。

2.细胞屏障或外排系统发生改变使胞质内抗菌药物浓度降低

①外膜蛋白(OMPs)发生改变：细菌的外膜是革兰阴性菌细胞壁的特有结构，位于细菌质膜(内膜)和肽聚糖层的外侧，包裹着整个细菌，是细菌重要的保护屏障。OMPs是细菌外膜的主要成分，包括脂蛋白、孔蛋白、铁调节蛋白、泵蛋白等，在细菌的生命活动中起有重要作用。OMPs不仅可介导Hp黏附，是Hp感染致病的关键蛋白，而且与Hp耐药密不可分[26]。研究[27]表明，Hp受抗菌药物刺激后，可上调OMPs基因表达，OMPs高表达可增强细菌外膜屏障的保护作用，使抗菌药物的渗透性进一步减弱，此是阿莫西林发生难治性耐药和克拉霉素耐药的另一种机制。OMPs基因HopB和HopC可使阿莫西林发生难治性耐药，HopB、HofC以及OMP31可使克拉霉素发生耐药[28]。

②细菌生物膜的形成：Hp感染人体后，附着于胃黏膜表面进行繁殖、分化，并向胞外分泌多糖基质如蛋白质、多糖、脂质、核酸以及一些保护性底物，菌体群落在这些胞外基质中互相黏附形成细菌聚集体膜状物，称为细菌生物膜。不同于浮游细菌，形成生物膜结构的菌群对外界恶劣环境有很强的适应能力，其中包括对抗菌药物的抵抗防御。研究[29]显示，有生物膜形成的菌体对抗菌药物的耐药性会增长10～1 000倍。此种高水平的耐药可能与生物膜介导的多种耐药机制相关：a.与OMPs高表达类似，生物膜的形成会给细菌提供更强的屏障保护作用。且有相关研究[30]表明生物膜的形成会促进OMPs的改变，进一步加强细菌对外界的防御能力。b.位于生物膜深层的细菌由于缺少营养物质和氧气会处于休眠状态。一般情况下，抗菌药物仅对处于活动期的细菌有良好的抑菌、杀菌作用，而位于生物膜深层的休眠期细菌不易被杀灭。c.细菌生物膜可与外排泵联合作用将进入生物膜中的抗菌药物泵出，如克拉霉素[30]。d.此外，有研究[31]显示生物膜的形成可能会诱导抗菌靶基因发生点突变以及生物膜胞外基质的一些酶水解抗菌药物，但具体机制尚待进一步明确。

③外排泵的参与：细菌的外排泵是位于细胞膜上的一类多药转运蛋白，可将进入菌体的抗菌药物泵出胞外，使菌体胞内抗菌药物浓度降低而发挥耐药作用。外排泵系统能参与多种抗菌药物的泵出如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四环素等，细菌发生双重或多重耐药的概率显著增加[32]。Hp外排泵家族分为5类：耐药结节分化(resistance nodulation-division,RND)家族、主要易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)、ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)超家族、小多重耐药(small multidrug resistance,SMR)家族以及多药和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)家族[33]。RND家族中的AcrAB-TolC外排泵是Hp最主要的多重耐药外排系统。hefABC、hefDEF以及hefGHI是3种编码AcrAB-TolC外排泵系统的同源基因[34]。安莹等[35]研究了敲除hefABC、hefDEF、hefGIH基因对Hp在克拉霉素耐药中的影响，与野生株Hp26695相比，敲除基因后的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)明显降低，证实了hef外排泵系统在克拉霉素耐药中的作用。Kutschke等[36]测定了野生株和基因突变株对12种抗菌药物的MIC值，结果发现70%的hefC基因突变株抗菌药物MIC值出现下降，其中克林霉素、四环素、头孢噻肟MIC值降低了8～16倍，证实了外排泵与细菌多药耐药的相关性。此外，有研究[37]显示，有生物膜形成的菌株中外排泵基因Hp605、Hp971、Hp1327的表达明显高于浮游株，提示外排泵与生物膜可发挥协同作用，以增加耐药性。

3.Hp球形变：通常情况下，Hp是一种革兰阴性螺旋杆菌，当外界环境不利于Hp的生长繁殖时，如缺少营养物质或氧气、pH值改变、抗菌药物干预等，螺旋形Hp会发生球形变，成为L形Hp[38]。球形Hp以两种形式存在：一种已死亡或变性，另一种处于非活动期，致病力相对减弱且对抗菌药物不敏感。目前认为处于非活动期的球形Hp在抗菌药物治疗期间启动了耐药逃逸机制，使抗菌药物的灭菌活性显著减弱。在停用抗菌药物2～4周后球形Hp可恢复原有的形态和活性，故球形变是Hp耐药、Hp长期慢性感染以及根除后复发的重要原因之一[39]。

4.诱导自噬：一般情况下，Hp感染人体后黏附于胃上皮细胞表面，是一种非侵袭性病原体。而有研究[40]显示在完全清除细胞外的细菌后，细菌会重新出现于细胞外环境中。Wang等[41]的研究发现，Hp可在胃上皮细胞、巨噬细胞以及树突细胞内存活和繁殖，提示Hp可介导自噬的发生。这些由于诱导自噬而存在于宿主细胞内的Hp可完美地避开细胞外抗菌药物的清除作用，且在慢性感染期在自噬体内继续存活繁殖造成持续或终身感染，提示在慢性感染期使用针对细胞内作用的抗菌药物或许会为治疗Hp持续感染提供新的思路。

5.细菌分泌酶使抗菌药物失去活性：目前发现β-内酰胺酶由Hp等分泌，可使β-内酰胺类抗菌药物(如阿莫西林)失活，这种酶能特异性打开β-内酰胺环，使阿莫西林失去其抗菌活性从而增加耐药性[42]。而Hp是否亦分泌其他酶以抵抗药物的灭菌作用仍待进一步研究。

6.毒力因子的参与：在Hp感染过程中，有多种毒力因子参与其中，如细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated protein A,CagA)、空泡细胞毒素A(vacuolating cytotoxin A,VacA)等。通常认为细菌分泌毒力因子与其致病性密切相关。而有研究[43]显示，CagA+菌株对抗菌药物的敏感性较CagA-菌株更强，提示毒力因子亦参与Hp抗菌药物的耐药过程，且毒力较弱的菌株较毒力较强的菌株能够更好地逃避抗菌药物活性。Hussein等[44]亦发现毒力因子十二指肠溃疡促进因子A(dupA)与A2147G克拉霉素耐药有显著相关性。对细菌分泌的毒力因子与Hp耐药机制之间的相关性研究有望为Hp的根除治疗打开一个新领域。

二、结语和展望

目前，虽然益生菌、中药、抗菌肽等新的治疗手段层出不穷，带有抗菌药物的三联或四联疗法仍是未来一段时间内根除Hp的主要手段，但关于Hp耐药机制的研究仍不够完善。因此，致力于寻找和剖析Hp对抗菌药物耐药的深层机制以改变Hp耐药率在国内显著增长的严峻现状显得尤为重要。本文从病原体的角度阐述了目前Hp抗菌药物耐药的主要分子机制，旨在为进一步降低Hp对抗菌药物的耐药率提供新的理论基础和思路。