自噬与氧化应激在缺血性脑卒中中的研究进展

陈 健，张 哲 综述 钟士江 审校

卒中是世界上同时拥有高致死率及高致残率的一种疾病，随着全球人口的增加，与卒中相关的“卒中人群”在过去数十年内呈现不可思议的上升趋势[1]。在很多地区，卒中已经成为了严重影响当地卫生健康的头号疾病[2]。在中国，因为老龄化等多种因素，卒中疾病的发生发展速度更是超过了之前任何时期。众多卒中患者因为瘫痪丧失自理能力，这无疑为我国的经济增加了巨大负担[3]。除此之外，对患者来说一个更严肃的问题是面对卒中所致的偏瘫，现有的临床技术更多时候只能延缓瘫痪的进程，而不能治愈瘫痪，其中一个重要因素就是治疗过程中缺血性脑卒中容易向脑出血转换[4]。虽然目前人们对脑卒中的研究已经足够多，但是超溶栓时间窗的卒中患者基本无法完全恢复身体健康[5]。因此，探讨新的治疗方案仍然是神内科医师追求的目标，笔者将较新颖的自噬机制与经典的氧化损伤途径在缺血性脑卒中中的最新进展做综述。

1 自噬对缺血性脑卒中的作用

1.1 自噬的主要特点 自噬是指细胞降解或循环胞质内的细胞器作为成分去维持代谢及细胞存活的一种细胞“自己吃自己”的过程。自噬在细胞内扮演着“管家”角色，自噬的过程有助于细胞清除衰老的细胞器、异常存活的错误折叠的蛋白质[6]。除此之外，自噬还参与了细胞生长发育分化的方方面面，自噬通过不同的转录因子调控参与到正常的细胞生化功能，参与调节细胞防御损伤，例如缺氧、活性氧、DNA损伤、蛋白质聚集、细胞内病原体清除等多项功能[7]。自噬缺陷往往会导致很多疾病，例如，神经退行性疾病、代谢性疾病及癌症，因此掌握自噬的机制对治疗这些疾病具有重要的意义。令人欣慰的是在这些疾病中，人们发现自噬的上调或许是一条比较好的治疗神经退行性疾病的治疗方案，研究者已经通过体内体外实验证明了自噬的上调可以清除位于神经细胞中的异常折叠蛋白质，延长细胞或动物模型的生存期[8]。另一方面，自噬在癌症与神经退行性疾病中又扮演着不同的角色，研究发现，自噬可以保护癌细胞免受免疫细胞攻击，抑制自噬或许对治疗癌症有帮助[9]。

自噬的双重角色作用意味着对于自噬的理解，我们目前的研究还很有限。目前来说自噬被至少30种自噬相关蛋白(ATG)调控，在复杂的ATG的调控下，这些被清除的细胞器或异常蛋白被隔离在一个双层膜的囊内，这个囊称之为自噬小体(autophagosomes)，最后通过自噬小体与溶酶体的定向结合，形成自噬溶酶体(autolysosomes)，衰老的细胞器或异常蛋白被降解，自噬过程完成[10]。被降解的内容物会重新参与到细胞能量代谢物质的合成，如氨基酸、核酸、糖或脂肪酸等[11]。自噬发生发展过程中有两种常用的作为检测自噬过程的蛋白，一种是LC3(Light chain 3)常作为自噬标志物，LC3-Ⅱ蛋白的增多常被认为是自噬小体的生成增加，或者自噬小体与溶酶体结合被阻止从而减少了LC3-Ⅱ的降解，因此单纯的Western blot实验证明LC3-Ⅱ升高并不能说明自噬过程的活化。另一个P62蛋白被认为是自噬底物，随着自噬进展P62蛋白逐渐被降解，判断自噬的进程常常需要借助这两种蛋白来综合分析。

1.2 缺血性脑卒中自噬异常 自噬在细胞中经常扮演着双刃剑的角色，适当的自噬被认为对缺血神经细胞是有保护作用的，过度的自噬又被认为是可以促进细胞死亡的[12]。急性的脑缺血能够导致氧和葡萄糖供应的减少，从而引起一系列的代谢变化，这一过程包括细胞能量供应不足导致的神经元死亡[13]。自噬也参与到了这种神经元缺血、缺氧诱导的死亡过程中。但是自噬的具体作用仍然未知，研究者已经得出了不同的结果：一部分人认为，早期缺血情况下诱导自噬可以保护神经元，减少缺血再灌注损伤[14]；另一部分人认为，抑制自噬才能有效保护神经元免受缺氧缺血诱导的损伤。这两类说法都不算少见，这种矛盾说法可能跟所用动物或者细胞模型及药物的选择有关。另外，受早期人们把自噬与自噬流阻滞混淆有关。但值得明确的是一些早就被证明有效的神经保护剂，如西罗莫司和白藜芦醇等也被证明能够通过调控自噬修复缺血缺氧诱导的神经元损伤。炎性反应也是缺血缺氧常见的一种损伤，自噬与炎性反应之间具有复杂的关系，缺血缺氧后的自噬可以减少细胞内炎性反应的发生。Nakahira等[15]发现LC3等自噬标记蛋白确实增强了脂多糖诱导的小鼠炎性因子的分泌。同样这些炎性因子如干扰素、IL-1/2等也可以调节细胞自噬的进展。故炎性反应与自噬之间必然存在某种复杂的联系，在脑缺血缺氧损伤中，这二者又是同样常见的病理过程，故研究二者的关系必将有助于进一步理解脑卒中的发病机制。

不同药物对自噬的调控作用可能存在着正好相反的结果，如Wang等[16]证明葛根素就是通过激活AMPK-mTOR-ulK 1通路来减轻自噬从而保护缺血的大鼠模型，而其他的研究者认为黄连解毒素是通过MAPK通路促进保护性自噬的发生达到保护脑缺血大鼠神经细胞的存活[13]。故自噬在脑缺血中扮演的仍然是双重作用的角色，这或许与不同的动物模型以及药物诱导有关，在自噬与脑缺血损伤的研究中，不同的药物引起的自噬可能是增强，也可能是阻滞，但是都可能会引起保护效应，这其中的具体机制有待研究。

2 缺血性脑卒中氧化应激的作用

2.1 氧化应激的主要特点 氧化应激(oxidative stress)是一种细胞内活性氧(ROS)生成增加与(或)ROS生成减少的失衡状态[2]。这两种情况中任何一种条件失衡都可能造成氧化应激。最常见的ROS成分包括超氧阴离子、次氯酸及其盐、脂质过氧化物等。在这一进程中ROS以及活性氮(RNS)受到氧化损伤、线粒体损伤、免疫调控等刺激连续产生[1，17]。ROS本身就是正常的氧化代谢环节中产生的副反应物，但是在应激情况下，ROS可能的生成远远超过了机体正常代谢的水平，从而过多的ROS会引起一系列级联反应对细胞造成损伤[18]。细胞线粒体是主要产生ROS的场所，线粒体也是细胞内通过复杂的氧化磷酸化途径给细胞功能产生ATP的部位，故ROS的过量产生势必会损伤线粒体的正常功能，最终影响细胞能量代谢。过量的ROS造成细胞的损伤，故氧化应激一直是研究项目中的热点，许多疾病包括心脑血管病、癌症、慢性代谢性疾病等都已证实有氧化损伤参与了其发生发展的一系列过程[19]。

中枢神经系统因为其独特的高代谢性、高ATP要求及抗氧化损伤能力的相对较小，故神经细胞是氧化损伤发生的一个重灾区[20]。上文已经说到ROS能损伤大分子物质，如核酸、蛋白质及脂质，故氧自由基尤其是超氧阴离子自由基等是脂质过氧化的重要损伤离子，脂质过氧化的最终产物如丙二醛(MDA)等物质会积累在细胞中，故可以利用MDA含量的检测来间接反映氧化损伤的程度。目前被认可的大分子氧化应激标志物有MDA、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)等。一边是氧化损伤造成的大分子氧化物生成，另一边机体就会利用内源的手段去阻止这种氧化损伤的进一步进行，细胞会消耗抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、NADPH等酶[21]。除此之外饮食因素也有助于细胞对抗氧化损伤，像食物中的维生素(C族和E族)、胡萝卜素、多酚等物质也具有抗氧化性[22]。除了饮食以外，生活环境因素同样对生物体内抵御氧化损伤有帮助，例如，很大一部分取决于生活方式、体育锻炼、吸烟习惯等等诸多因素，这些细胞内外的条件综合决定着人类抗氧化损伤能力的强弱或者氧化应激发生的概率[23]。最后基于基因组学等各项新方法的研究，人们已经发现在肿瘤中存在着明显的氧化应激异常，ROS可以攻击遗传物质、故遗传物质的损伤很容易出现原癌基因与抑癌基因的突变[24,25]。

2.2 缺血性脑卒中氧化应激异常 虽然目前普遍认为ROS造成的氧化损伤是诸多疾病及生理环境失衡的根本，但是也有不一样的声音。Gems和Partridge[26]就认为低度的氧化损伤不仅不会造成细胞受损，反而会使细胞具有抵御高危险损伤的能力。如果我们可以人工干预细胞应对ROS的氧化应激，那就很有可能改变各种与氧化应激相关疾病的预后。前面已经提到神经细胞因为其独特的生理特性，故面对缺血缺氧诱导的氧化损伤更加敏感。缺血缺氧诱导ROS的产生可能有如下原因：缺血缺氧直接诱导、炎性细胞(小胶质细胞和中性粒细胞)可以产生自由基[27]。另外，氧自由基攻击细胞膜脂质，造成细胞膜损坏，胞膜通透性增加、Ca离子内流[28]，同时增加的离子紊乱扰乱线粒体内能量代谢，钙泵、钠泵被抑制，氧化磷酸化途径被阻滞，最后细胞ATP供应不足而死亡[29]。

在缺血性脑卒中患者身上发现氧化的血清白蛋白增加，这可能与ROS氧化氨基酸残基有关[30]，这提示了ROS在缺血性脑卒中扮演了重要的作用。正常条件下，脑内通过一系列抗氧化酶来防止ROS的过量产生，将自由基维持在一个健康的水平，这些内源性酶如SOD、GPX、CAT再加上外援的小分子抗氧化剂(维生素C/E等)共同构建脑内氧化与抗氧化的平衡。在急性缺血性脑卒中患者血液里大多数抗氧化剂(维生素C/E)都有明显的下降[31]，这说明了在缺血性脑卒中患者体内发生了剧烈的抗氧化反应。当这一内源性抗氧化酶加外源性抗氧化小分子无法阻止ROS的继续生成，神经细胞受损的一系列症状就开始逐渐发生，包括脂质、蛋白质、DNA的氧化受损等，最终都导致一个结局神经细胞死亡，炎性反应启动，同时炎性反应又可以继续激活ROS生成，形成一个恶性循环。故有效的制止氧化损伤是缺血性脑卒中治疗的一个关键步骤。目前有一些公认ROS清除剂被广泛运用于临床或者科研，像NAC、维生素E、依达拉奉等药物。依达拉奉在数个临床试验中都被证明了可以减少缺血性脑卒中的缺血灶，同时在动物实验中被证明减轻了血脑屏障的损伤[32]。尽管在抗ROS实验中我们有许多药物被不断地发现，但是实际运用临床，包括依达拉奉在内的许多药物依然表现不佳[33]。这提示我们ROS在缺血性脑卒中里发挥的机制并不是我们目前所知道的那么简单，这其中可能还有更深层次的关系等待去研究。

3 自噬与氧化应激的交互

在缺血缺氧的动物模型中都已经观察到了自噬与氧化损伤的激活，但是既往的实验很少把这两种机制联合起来研究，在ROS激活的线粒体损伤中，自噬是会随之激活促进受损的线粒体分解，保护细胞的稳态[34]。虽然自噬在神经元死亡过程中究竟如何发挥作用仍然未知。已经有学者发现ROS导致细胞内能量失衡时会活化AMPK通路[35]，然后通过复杂的AMPK-TSC1-TSC2-RHEB 调控，最终抑制mTOR 蛋白促进自噬激活[36]。同时新的发现提示神经元轴突富含线粒体，也是ROS产生的主要部位，在轴突的急性损伤中，线粒体内大量ROS可以通过PARK2/PARKIN激活线粒体自噬[37]。不仅仅是针对缺血性脑卒中，在帕金森这样的退行性疾病进程中同样涉及到ROS诱导Parkin/PINK 1依赖的线粒体自噬的启动[38]。

研究发现ROS中的H2O2及超氧负离子主要承担调控自噬的作用[39]，当这两种自由基明显升高后，就会通过一种稳定的刺激经P13K-Akt通路抑制自噬，但这种抑制作用可以通过阻滞Akt或MTROC 1来重新激活[40]。尽管目前自噬对细胞生存还是死亡的影响尚不清楚。

除了ROS可以调控自噬通路以外，自噬也可以调节体内氧化应激。细胞通过自噬降解衰老或损伤的线粒体，减少ROS的产生。机体内最重要的抗氧化通路Keap 1/Nrf2/Are在抵抗ROS诱导损伤中起着决定性作用，当收到氧化应激时，Keap 1与Nrf2解耦联，活化Nrf2,起到抗氧化损伤的作用，但如果ROS过度产生，超过细胞正常调节能力，Nrf2则会受到抑制。P62作为自噬底物，也可以调控Keap 1/Nrf2/Are通路，磷酸化的P62可以增加与Keap 1结合的活力，而Keap 1失去了与Nrf2结合的机会，多出来的Nrf2可以入核调控ARE抗氧化元件[41]。这再次说明了自噬与抗氧化调节在细胞内的相辅相成。

综上所述，氧化应激和自噬在多种生理或病理情况下发挥着各自的作用，之前的研究由于观点的不清楚，大多数没有把它们二者综合考虑，但随着人们理解的进一步深入，这两者之间相互联系的关系逐渐浮出水面。这无疑为大多数疾病的病理生理提供了新的理解。越来越多的研究将目光放在了自噬与氧化损伤的共同作用，并且发现这种综合考虑的治疗方案同样在体内体外实验上取得好的结果[42]。这也大大鼓舞了下一步研究方向的展开。未来的研究应该从ROS产生的机制入手，阻止ROS的过度生成，这可能会带来更好的疗效。另一方面，自噬在大多数疾病中的双重作用也有待去深入研究，但毋庸置疑的一点是，自噬与氧化应激是一个整体，只有在综合考虑下才可能找到治疗缺血性卒中、神经退行性疾病的更好方案。