NPRL2在结直肠癌中的抗肿瘤作用

何丽媛， 陈 晶， 刘艾芸

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150086

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康，全世界CRC的发病率正在逐年上升[1-2]。美国癌症协会调查发现，50岁以下年龄段的CRC发病率近年来有明显的上升趋势[3]。中国近10年来CRC发病率和死亡率均呈明显的升高趋势[4]。在CRC早期或腺瘤期发现病灶并及时切除是降低CRC患者相关死亡率的有效方法。术后有效的药物治疗有利于预防CRC的复发，延长患者的生存时间[5]。虽然结肠镜水平较前有很大的进步，化疗药物的种类和疗效较前也有所提高，但目前CRC的预防和治疗仍是重大的公共卫生问题。这些情况表明，早期诊断CRC进而采取相应治疗措施是非常有必要的，其中早期诊断显得尤为重要。CRC从腺瘤到侵袭性癌的进展是一个多步骤、多因素综合参与的复杂生物学过程，一系列癌基因和抑癌基因的异常表达与CRC进展密切相关，其中抑癌基因表达受到抑制被认为是触发肿瘤发生的重要机制[6]。因此，通过检测某些基因从而在肿瘤早期及时干预并阻止肿瘤进展能大大提高CRC的早期诊断和预后。

1 NPRL2基因结构及生物学功能

1.1 NPRL2基因的结构NPRL2(又称抑癌候选基因4,TUSC4)早在30年前就被认为是抑癌基因，在生物物种间具有高度保守性。NPRL2位于染色体3p21.3区域，有学者发现，NPRL2基因及其产物在人类多种癌组织和癌细胞系中出现了功能障碍和大量蛋白表达丢失的现象，其机制可能是基因异常剪接、转录及多个外显子缺失或基因内纯合子缺失导致NPRL2基因克隆的无义和错义突变，结果为NPRL2基因表达下调或沉默[7]。NPRL2的杂合性丢失和纯合子缺失经常发生在人类各种类型癌症的早期发展阶段[7-8]。NPRL2基因通过不同剪接方式编码成多种剪接异构体在不同组织中表达。NPRL2蛋白是NPRL2基因编码的由380个氨基酸组成的蛋白质，表达于人体多种组织和器官，包括肺和睾丸[7]。

1.2 NPRL2基因在肿瘤组织中的生物学功能人类多种正常组织可以表达NPRL2基因，但发现在一些肿瘤组织中NPRL2基因表达较正常组织减少或增加[9-10]。先前的研究已经发现，在哺乳动物中，NPRL2可以抑制细胞生长并增强对包括顺铂在内的许多抗癌药物的敏感性[11]。在前列腺癌的研究中发现，NPRL2基因在前列腺癌组织中表达异常升高，干扰NPRL2在前列腺癌组织中的表达后，癌组织的凋亡增加，侵袭和转移受到抑制[12]。有研究发现，NPRL2在人类胶质瘤中的表达降低，上调NPRL2表达可以通过抑制PDK1-AKT1信号通路及其下游基因的活性，显著抑制胶质瘤的增殖[13]。在一些肿瘤的研究中发现，NPRL2基因的抑癌效果可能是通过参与DNA错配修复、调控细胞周期信号传导、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖等途径作用的[7-8]。此外，NPRL2基因过表达可通过抑制自噬相关通路的mTORC1蛋白，促进肿瘤细胞的自噬，抑制凋亡，促进肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，进而促进肿瘤的进展，这一机制已在前列腺癌的研究中被证实[14]。共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutated，ATM)是与DNA损伤检验有关的一个重要基因，前列腺癌细胞中ATM蛋白水平高于正常组织，p-ATM(phospho-ATM)是ATM的磷酸化形式，p-ATM的激活可促进肿瘤细胞存活。NPRL2是ATM的正调控因子，在前列腺癌的研究中发现，NPRL2通过增加ATM和p-ATM，保护前列腺癌细胞，促进其生长[15-17]。由此看出，抑癌基因NPRL2通过不同的信号通路对不同类型肿瘤组织的发生、发展和预后产生不同的效果。

1.3 NPRL2基因的其他生物学功能有学者发现，敲除了NPRL2基因的动物肌肉纤维明显更大，纤维型组成改变，快速收缩糖酵解纤维增多，慢收缩氧化纤维减少[18]。敲除了肌肉中NPRL2基因后的小鼠跑步行为发生了改变，葡萄糖耐量比之前增强。此外，还发现NPRL2基因的缺失会诱导有氧糖酵解并抑制葡萄糖进入柠檬酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)[18]。NPRL2基因的突变与局灶性癫痫发作有一定联系[19]。此外，还发现NPRL2突变体果蝇的胃肠道衰老过程加快。NPRL2突变体果蝇的中肠可表现出肠道长度短、肠道干细胞增殖率高、代谢功能紊乱等与年龄相关的表型[20]。

2 NPRL2在CRC中的抗肿瘤作用

2.1 NPRL2在CRC组织及外周血中的表达在CRC的研究中发现，CRC组织中NPRL2 mRNA和蛋白水平较正常结肠组织均明显降低[21]。相关实验证实，在腺瘤期NPRL2蛋白表达已经开始降低，低分化肿瘤中NPRL2的表达显著低于高分化或中分化肿瘤，在CRC中该基因表达显著低于腺瘤[21]。结直肠肿瘤中NPRL2 mRNA表达随着肿瘤进展和组织学分级而降低[21]。血液中NPRL2 mRNA表达水平与肿瘤组织中NPRL2 mRNA表达水平呈正相关。腺瘤患者血液中的NPRL2 mRNA水平明显低于正常组[21]。综上，NPRL2与CRC发生、发展有关，并且该基因的表达水平与CRC组织分化程度相关。在CRC患者中外周血中NPRL2 mRNA水平低于正常人这一发现提示我们，NPRL2相关的血清学检查有望成为发现早期CRC的一种手段，但具体的灵敏性和特异性还需进一步的研究。

2.2 NPRL2对CRC的影响

2.2.1 NPRL2通过调节细胞周期进而抑制CRC的发生、发展：NPRL2作为抑癌基因能有效调节CRC细胞的细胞周期，使其受阻于G1期，并抑制CRC细胞增殖，阻止CRC细胞侵袭及迁移[22]。这一发现为NPRL2抑制CRC发生、发展提供了强有力的证据。

2.2.2 NPRL2促进CRC细胞的凋亡和自噬：细胞凋亡也被称为细胞程序性死亡，是细胞停止生长和分裂，最终进入一个导致细胞受控死亡的过程，其内容物不会泄漏到周围环境中。然而，细胞凋亡机制的失控是癌症的一个标志。细胞凋亡过少会导致在癌组织中观察到的细胞不受控制地生长和分裂[23]。DNA损伤诱导细胞凋亡可以清除癌前病变中潜在的有害细胞，从而阻碍肿瘤的生长。细胞凋亡的改变不仅与肿瘤的发生、发展有关，还与肿瘤对治疗的耐药性有关[24]。

自噬是一个将细胞成分如大分子蛋白质甚至整个细胞器通过双膜自噬体结构包裹运输到溶酶体降解的过程。降解产物中的一些成分既可以被循环利用来创建新的细胞结构和细胞器，也可以被进一步加工和用作能源以支持代谢和促进细胞存活[23]。自噬过程是一个保持细胞稳定状态的重要机制，其失调参与了多种疾病发生，如代谢紊乱、神经退行性疾病、自身免疫改变和癌症，可以利用自噬来清除衰老细胞和破坏肿瘤病变[25]。调节自噬被认为是一种潜在的治疗癌症的策略。

NPRL2转染的CRC肿瘤细胞中，抗凋亡因子Bcl-2降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高[22]，进一步提示了NPRL2可能通过促进CRC细胞的凋亡抑制肿瘤进展。既往在CRC的研究中发现，NPRL2基因过表达能够促进CRC HT29细胞的自噬，但这种自噬可以抑制由NPRL2基因引起的凋亡[26]。研究还发现，NPRL2诱导的CRC HT29的自噬可以被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制，导致肿瘤细胞活性降低，增殖被抑制，凋亡被促进[26]。NPRL2既能促进CRC组织的凋亡，又能促进自噬，这提示我们可以通过基因治疗的手段将NPRL2促进CRC组织凋亡和自噬的作用效果放大，进而抑制CRC的发生、发展。

2.2.3 NPRL2与化疗药物共同作用促进CRC细胞对化疗药的敏感性：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)多年来一直是CRC的首选化疗药物，有研究表明，NPRL2过表达通过下调PI3K/Akt/mTOR网络功能，增强5-FU敏感性，导致CRC细胞增殖受到抑制，G1细胞周期阻滞。NPRL2转导和5-FU分别处理CRC细胞后细胞凋亡明显增加。且NPRL2过表达和5-FU联合治疗对细胞凋亡的促进作用比单独干预更显著[27]。有研究表明，NPRL2可通过抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，调节PI3K/Akt/mTOR信号通路活化等途径来增加奥沙利铂(Oxaliplatin，L-OHP)的治疗敏感性，逆转肿瘤细胞对L-OHP的耐药性[28]。另外研究发现，NPRL2过表达可通过激活DNA损伤检查点途径抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡和G2/M细胞周期阻滞，从而提高伊利替康的敏感性[29]。NPRL2与化疗药物共同作用于CRC促进化疗药物对肿瘤组织的敏感性，促进肿瘤组织凋亡，提示我们可以将基因治疗和化疗药物联合以改善CRC的治疗效果。

2.2.4 体内实验证实NPRL2在CRC中的抗肿瘤作用：体外实验对于评估CRC治疗的可行性和有效性有一定的局限性，有学者通过建立CRC裸鼠异种移植模型证实了NPRL2在体内对CRC组织的抗肿瘤作用。体内实验发现，NPRL2转染的肿瘤组织中抗凋亡因子Bcl-2降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高，磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)下调。活性结构Akt已经在人类的多种癌症中被证实，Akt的不受控制的激活会导致癌症的发展。这些结果与体外实验NPRL2促进CRC肿瘤细胞凋亡的结果一致。在CRC体内异种移植模型中，NPRL2降低了肿瘤体积和重量，增强了细胞凋亡[30]。体内实验进一步证实了NPRL2在CRC中有抑制肿瘤组织进展的作用。

体内实验同时验证了NPRL2具有增强CRC细胞对L-OHP和5-FU敏感性的作用。多重耐药(multi-drug resistance，MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是最具特征的MDR转运蛋白，是公认的肿瘤治疗中战胜MDR的靶点[31]。MRPs，特别是多药耐药蛋白(multidrug resistance protein 1，MRP1)，促进对化疗药物的耐药性[32]。NPRL2转染和L-OHP、5-FU处理肿瘤后，P-gp和MRP1的表达降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高，抗凋亡因子Bcl-2降低[30]。这一结果表明，体内实验中NPRL2也能降低CRC对化疗药物的耐药性，NPRL2联合化疗药物可以促进CRC细胞的凋亡。

体内实验为NPRL2抑制CRC组织发生、发展提供了更有力的证据。同时，体内实验中将NPRL2装载进慢病毒中，然后通过静脉注射的方式将慢病毒导入CRC裸鼠异种移植模型，使其过表达NPRL2，这种方法给我们基因治疗CRC的方式予以提示。

3 总结

综上所述，抑癌基因NPRL2能通过调节CRC细胞周期抑制CRC细胞的发生、发展，并且能促进CRC细胞的凋亡和自噬，增强CRC细胞对多种化疗药物的敏感性。体内实验进一步表明，NPRL2通过调控凋亡因子和Akt的激活发挥抗肿瘤作用，并且可以增强CRC细胞对L-OHP和5-FU的敏感性。这些结果提示我们NPRL2基因有望成为CRC新的治疗方向，并且将NPRL2与药物联合可以作为CRC新的治疗策略。肿瘤发生、发展机制多种多样，NPRL2基因对于CRC的抑制作用或许远不止是通过抑制细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡和自噬这几种方式，探索NPRL2基因抑制CRC进展作用的其他方式或通路很有必要。但同时，由于NPRL2在人体多种正常组织中均有表达，还发现在前列腺癌等组织中NPRL2能促进肿瘤组织生长，因此，要将NPRL2应用到CRC的基因治疗中，仍有很多问题需要解决。