固态微生物混合型饲料添加剂产品稳定性影响因素研究

裴朝东

（广西工商职业技术学院，广西南宁530008）

我国饲料工业经过多年的快速发展，逐步形成了饲料添加剂及配合饲料等系列产品，为发展现代养殖业提供了有力支撑。但随之而来的是抗生素的大量使用和由养殖业带来的日益严重的环境问题。根据农业农村部194号公告要求，自2020年1月1日起，将退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。2020 年，饲料行业、养殖业开始为禁抗、减抗、替抗做出调整和改变。与此同时，枯草芽孢杆菌等34 种微生物和13 种酶制剂可以应用到饲料和饲料添加剂等产品中[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属于芽孢杆菌属，大小（宽度×长度）为（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，属革兰氏阳性菌[2]。多项研究表明，枯草芽孢杆菌在养殖行业中的作用非常明显。钟光等（2020）向肉鸡日粮中添加枯草芽孢杆菌，提高肉鸡的免疫力[3]。冯英珍（2020）在仔猪日粮中添加枯草芽孢杆菌和杜仲叶提取物，腹泻率降低约40%～50%[4]。蔡艳等（2018）在水产养殖中用枯草芽孢杆菌代替抗生素，改善了养殖的水质[5]。这些研究均强调了枯草芽孢杆菌在畜禽、水产养殖中的重要作用。研究发现，水分、载体含量大小对活菌数的影响存在某种非线性影响。目前关于对微生物类混合型饲料添加剂产品在保质期内的稳定性的研究不多。基于以上研究情况，本试验以枯草芽孢杆菌活菌数为衡量指标，通过对产品的水分含量以及喷浆玉米皮、豆粕、黄芪、甘草等组分的分析，研究各因素对产品的影响情况，为固态微生物混合型饲料添加剂类产品在保质期内的产品稳定性研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 载体

本试验以喷浆玉米皮、豆粕、黄芪、甘草、石粉为载体，按要求混合而成，各成分均符合《饲料原料目录》和《饲料添加剂品种目录》要求。原料经粉碎，过16目和24目标准筛，24目标准筛筛上物少于10%。

1.2 试验菌粉

试验所用的枯草芽孢杆菌，粉状，来源于山东蔚蓝生物科技有限公司，活菌数1 000×108CFU/g。

1.3 基础组方与测定指标

1.3.1 试验材料及基础组方

试验所用的混合型饲料添加剂为枯草芽孢杆菌，以喷浆玉米皮、黄芪、豆粕、甘草等为载体，加入枯草芽孢杆菌混合而成，各成分的组方范围为：喷浆玉米皮21%～33%、豆粕12%～18%、黄芪5%～14%、甘草3%～12%、枯草芽孢杆菌4%。将载体按组方混合，用快速水分测定仪初测水分后，根据组方对水分的要求，适当调整水分到该组方的水分，将枯草芽孢杆菌加入，混合均匀，将试样用自封样品袋分装为8 袋，每袋250 g，模拟产品的包装及保存状态，放置72 h 后，开始检测枯草芽孢杆菌的活菌数。

1.3.2 测定指标

测定样品中枯草芽孢杆菌活菌数的含量。

1.3.2.1 菌落计数

采用涂布法[6]和平板倾注法[7]相结合的方法计数。

1.3.2.2 培养基

枯草芽孢杆菌测定所用的培养基为NA营养琼脂培养基，购自杭州百思生物技术有限公司。

2 试验设计与试验过程

2.1 试验设计

试验使用DPS数据处理系统15.10高级版中的均匀试验设计法，表1为产品稳定性影响因素均匀设计水平参数，4水平5因素16处理的均匀设计表U16(45)，如表2所示。

表1 产品稳定性影响因素均匀设计水平参数

将表1所列的数据填入表2中，并按上述1.3.1要求完成分装和测定，均匀试验结果如表3所示。

2.2 试验结果分析

试验数据用Excel 2007 进行初步整理后，采用SAS9.2软件建立二次响应曲面回归模型，考察因变量Y（活菌数）与自变量X1、X2、X3、X4、X5（水分、喷浆玉米皮、豆粕、黄芪、甘草含量）之间的关系。

2.2.1 回归模型建立

利用SAS9.2 软件进行二次响应曲面的回归模型建立，其基本思路是，假设响应量（因变量）与自变量（观测值）之间满足某种二次函数关系，而且每个因素（自变量）的测量观测值都测三个以上的不同值，则可以通过最小二乘估计法来拟合影响因素和响应值之间的函数关系。假定因变量Y在五个自变量X1、X2、X3、X4、X5 的组合上被测量，则可得因变量Y 的二次响应模型的回归方程。

Y=β0+β1×X1+β2×X2+β3×X3+β4×X4+β5×X5+β 6×X11+β7×X21+β8X22+β9×X31+β10×X32+β11×X33+β12×X41+β13×X42+β14×X43+β15×X44+β16×X51+β17×X52+β18×X53+β19×X54+β20×X55

表2 产品稳定性影响因素均匀设计方案

表3 产品稳定性影响因素样品均匀试验结果

启动SAS9.20 软件，进入Editor 窗口，输入如图1所示各语句，用run运行后，得到SAS数据集。

它包含6 个变量，其中Y 代表样品中的活菌数；X1 代表样品中水分的含量；X2 代表喷浆玉米皮含量（%）；X3 代表豆粕含量（%）；X4 代表黄芪含量（%）；X5 代表甘草含量（%）。根据SAS 语法规则，model 语句中，必须先对变量X1、X2、X3、X4、X5 用sort 排 序，在RSREG 方法 中，选 择lackfit 选项进 行二次响应回归分析。输出结果如图2、图3、图4、图5 所示。

2.2.2 数据分析

2.2.2.1 模型优化

根据式2.2.1节二次响应模型的回归方程所列各系数分布情况，结合图5回归模型的各系数，排除响应不显著4 个值X5、X31、X31、X41，以及系数为0 的值，得到样品中活菌数的二次响应回归模型的方程。

2.2.2.2 曲面响应分析

从图3所示可以看出，模型的二次响应曲面的稳定点是一个鞍点（saddle point），并且在同一个平面内，稳定点的值是62.960 330，五个因素的稳定点坐标分别为X1=18.133 187，X2=28.248 542；X3=16.813 337；X4=5.720 995；X5=4.500 000，因此，可通过优化模型中的五个影响因素（X1、X2、X3、X4、X5）的值，特定条件下通过分析样品中的活菌数变化情况，最大程度优化五个影响因素对活菌数的影响情况，但无法通过优化让活菌数达到最大值或最小值。

图1 试验数据的SAS程序及说明

图2 最佳响应面输出结果

从图2最佳响应输出结果来看，二次响应曲面回归模型是显著的（总的显著概率为Pr＞F=0.01,该值小于0.05为显著），线性项（Pr＞F=0.006 1）和二次项（Pr＞F=0.017 2）是显著的。模型总的决定系数为R2=1.000 0，其中二次项和线性决定系数分别为0.063 1和0.895 1。

从图4各因素对结果响应的显著程度来看，各因素的响应程度分别为:X1(Pr＞F=0.011 2)＞X4(Pr＞F=0.027 4)＞X3(Pr＞F=0.032 3)＞X2(Pr＞F=0.036 3)＞X5(Pr＞F=0.186 8)，这就意味着，在五个影响因素中，水分含量的高低对样品中的活菌数的影响最大，其次是黄芪、豆粕的含量大小；甘草的含量多少对样品的活菌数影响不大。

3 试验结论

通过利用SAS 软件进行二次曲面响应回归模型的构建与分析，得到以下结论。

①以喷浆玉米皮、豆粕、黄芪、甘草等为载体，以枯草芽孢杆菌为主要成分的固体微生物混合型饲料添加剂，在产品保质期内，各因素对样品活菌数的影响呈二次曲面响应状态，符合二次响应曲面模式。

②在5个影响因素中，水分的高低是主要的影响因素，其次是黄芪含量的大小，因此，以上述所列成分为载体的固态微生物混合型饲料添加剂产品，在保质期内要严格控制产品的水分，才能保证产品的效果。

图3 响应曲面的特征向量值

图4 各因素对结果响应的显著程度

③样品中的水分超过18.13%、喷浆玉米皮含量超过28.25%、豆粕超过16.81%，则产品在保质期内的稳定性则不可预测，变得更不易保存。

4 讨论

固态微生物混合型饲料添加剂在保质期内水分是影响产品稳定性的重要指标之一。本试验反映了载体的水分高低、黄芪等组分含量的大小等因素对产品中枯草芽孢杆菌活性的影响程度，其可能的影响机理包括以下几种。

①水分是主要影响因素，本试验研究表明，产品水分超过18.13%，则变成不稳定因素。枯草芽孢杆菌为好氧菌，在其繁殖过程中，产芽孢的多少是衡量其活性的重要指标，芽孢的形成受营养及环境的双重调控[8]。在真空或包装中，枯草芽孢杆菌繁殖过程需要的氧，一方面来自包装袋中留存的氧气，另一方面来源载体水分中的游离氧，这种好氧发酵的过程非常复杂，一方面枯草芽孢发酵过程能充分利用包装袋中的氧分子及载体水分中的游离氧，但水分太高，水分中的杂质、杂菌等对芽孢的繁殖过程又产生了相应的抑制作用，其影响机理有等进一步研究。

②本试验中，黄芪及甘草等载体含量对枯草芽孢杆菌活菌数的影响，主要作用机理尚不明确，一般研究理论认为，枯草芽孢杆菌在发酵过程中产生的纤维素酶能破坏中药的细胞壁，使黄芪多糖、甘草类黄酮等中药有效成分充分释放出来，有效提高中药的药效和营养价值[9]。但黄芪多糖、甘草类黄酮等中药成分又具有一定的抑菌作用，尽管这种抑菌作用一般研究认为是对有害菌繁殖的抑制，但浓度达到一定量后，是否也对枯草芽孢杆菌的繁殖有一定的抑制作用，有待进行深入研究。

图5 回归模型的系数

③喷桨玉米皮含量对产品稳定性的影响可能与其特有的加工工艺及其易产生真菌毒素有关。根据《饲料原料目录》中对喷桨玉米皮的定义，喷桨玉米皮是玉米经浸泡液浸泡后干燥粉碎而成，其含有的糖分为枯草芽孢杆菌的发酵提供了部分碳源，但玉米在水分及温度适宜的情况下极易产生真菌毒素，真菌毒素含量的升高，打乱了枯草芽孢杆菌繁殖过程中的平衡，从而抑制枯草芽孢杆菌的繁殖，其详细的作用机理有等进一步深入研究。

④豆粕等载体含量对活菌数的影响尚不清晰，其机理有待进一步研究。