人类miR-146a-5p靶基因预测及生物信息学分析

王 道，朱洪怡，楚 毅*

（中南大学湘雅二医院 a. 妇产科；b. 消化内科，长沙 410011）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由18到22个核苷酸组成的短RNA分子［1］，可以调节转录后基因的表达并且促进个体发育、细胞分化、机体炎症、免疫反应和癌变［2-6］等过程。这些分子通过与相应的mRNA相互作用从而形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），能够结合到3'非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）的互补序列，引起表达失调进而破坏信号传导途径增加人类患疾病的风险［7］。此外，许多研究报告表明miRNA是基因表达的关键调节剂，将可能成为生物标记物的候选者［8］。

人类miR-146a-5p（hsa-miR-146a-5p）自2006年被David Baltimore实验室在小鼠中鉴定发现后，其功能被一些研究证实在多种类型的癌症中起抑制基因的作用［9-10］。但是，还有研究表明miR-146a-5p在多种类型的癌症中起癌基因作用［11-12］。目前研究人员仍然对miR-146a-5p引起肿瘤的分子机制非常感兴趣，如Li等［13］对miR-146a-5p在各种恶性肿瘤中的预后价值进行全面荟萃分析，提出miRNA可能是早期预测癌症的突破口。

本研究中我们采用多种生物信息数据库提取hsa-miR-146a-5p的靶基因数据交集，并对其进行全面的基因本体（gene ontology，GO）注释分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析，为未来对miR-146a-5p的靶基因分类鉴定及其在疾病中扮演的角色提供新的研究线索。

1 材料与方法

1.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性的预测分析

利用UCSC（http://genome.ucsc.ed）等在线数据库查找hsa-miR-146a-5p的碱基序列、染色体定位、物种保守性等基本信息；miRbase（http://www.miR-base.org/）在线数据库搜寻hsa-miR-146a-5p在染色体的分布位置；使用Clustal Omega软件分析16个不同物种如智人（Homo sapiens）、黑猩猩（Pan troglodytes）、小家鼠（Mus musculus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）、青鳉（Oryzias latipes）、家兔（Oryctolagus cuniculus）等的成熟序列的碱基信息并预测其保守性（表1）。

1.2 hsa-miR-146a-5p在人类不同组织中的表达分析

运用miGator v3.0数据库（http://mirgator.obic.re.kr/）检索hsa-miR-146a-5p在人类不同组织器官中的表达量，并且进行预测分析。该数据库的测序数据均来自已发布的肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等的多个人类miRNA数据集。

1.3 hsa-miR-146a-5p靶基因以及编码蛋白质间的相互作用分析

通过最新版PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）检索近年来发表文献得出，hsa-miR-146a-5p在转录后水平上介导调控相应的靶基因，涉及参与了一系列疾病的发展和预后疗效的评价（表2）。采用 Targetscan7.1（http://www.targetscan.org /vert71/）、miRDB（http://www.mirdb.org/）、mirDIP（http://ophid.utoronto.ca /mirDIP /index confirm.jsp）和DIANA TOOLS（http://diana. Imis. athena-innovation.gr/Diana-Tools/index.php）4个在线靶基因预测工具预测靶基因，并用Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny /index.html）绘制4个数据库预测靶基因的韦恩图，取交集作为下一步靶基因数据集。将此数据集导入String 11.0数据库（http://www.string-db.org）进行蛋白互作预测分析，然后结合Cytoscape-v3.6软件构建靶基因编码的蛋白间相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图。

1.4 hsa-miR-146a-5p靶基因的GO注释分析和KEGG富集分析

运用Omicshare平台工具（http://www.omicshare.com/）对韦恩图的交集靶基因进行GO注释分析。基于超几何分布计算原理，从基因功能的3个方面：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP），得到具有统计学意义的GO注释显著性分析（P＜0.05）。同时，利用KOBAS数据库（http://kobas.cbi.pku.edu.cn）对交集靶基因进行KEGG通路相关的具有统计学意义的富集分析（P＜0.05为显著性阈值）。

2 结果与分析

2.1 hsa-miR-146a-5p的定位和序列保守性分析

在线检索miRBase、UCSC数据库发现hsa-miR-146a-5p基因序列号为MIMAT0000449，定位于人类基因组chr5q33.3染色体（图1），其基因位点在chr5:160 485 373～160 485 393之间。通过miR-Base 在线数据库检索miR-146a-5p成熟序列，结果显示，已知的22个不同物种中存在成熟序列。我们下载了智人、小家鼠、褐家鼠、青鳉、家兔等16个不同物种的成熟序列（图2）。Clustal Omega软件预测结果表明，hsa-miR-146a-5p成熟序列“UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU”在16个物种之间具有高度的保守性（表1），提示hsa-miR-146a-5p可能具有潜在的生物学功能。

图1 hsa-miR-146a-5p在人类基因组中所处的位置Fig. 1 The location of hsa-miR-146a-5p in the human genome

图2 不同物种miR-146a-5p的成熟序列Fig. 2 Mature sequence of miR-146a-5p in different species

2.2 hsa-miR-146a-5p在人类各组织的表达分析

hsa-miR-146a-5p在人体部分组织器官的表达情况见图3，其中在淋巴细胞表达丰富程度最高，但是在其他组织中的表达量很低。

2.3 hsa-miR-146a-5p的靶基因预测结果

利用新版PubMed、EBSCO快速全面检索相关文献，纳入结果的文献表明hsa-miR-146a-5p调控相应的靶基因参与了多种疾病以及多条信号通路（表2）。选用TargetScan、miRDB、mirDIP和DIANA TOOLS 4个在线数据库预测的靶基因个数分别为283、488、828和853。最后通过在线软件Venny2.1对上述4个数据集合绘制韦恩图推导靶基因交集（图4），以备后续数据分析，具体见表3。

表1 不同物种miR-146a-5p成熟序列Tab. 1 Mature sequence of miR-146a-5p in different species

表2 hsa-miR-146a-5p调控的靶基因参与人类疾病Tab. 2 hsa-miR-146a-5p target genes involved in human disease

图3 hsa-miR-146a-5p 在各个组织器官中的表达情况Fig. 3 Expression analysis of hsa-miR-146a-5p in organs

表3 hsa-miR-146a-5p调控的靶基因数据集Tab. 3 Target gene data sets regulated by hsa-miR-146a-5p

2.4 靶基因编码蛋白质间的相互作用预测

将4个数据库预测到的靶基因交集导入String 11.0，分析靶基因编码蛋白质间的相互作用。然后，将String11.0分析结果结合Cytoscape_v3.8.0软件构建PPI图。PPI结果显示，hsa-miR-146a-5p的靶基因编码蛋白质间形成了复杂的网络互作图。红色连线代表比绿色打分相对较高，说明蛋白相互作用更强；蓝色圆圈代表靶基因编码的蛋白节点（图5）。

2.5 hsa-miR-146a-5p的GO注释分析

将韦恩图交集得到的73个靶基因格式整理后提交到Omicshare Tools平台。GO注释分析结果表明：hsa-miR-146a-5p靶基因主要富集于细胞，包括细胞器、细胞膜及附近区域等14个细胞组分；涉及到22个生物学过程，包括细胞合成及代谢、应激反应、信号通路、正或负调控发育等；显著富集于染色质结合、转录活性激活、结构分子活性激活、催化活性激活、转录因子活性配体激活等9个分子功能（图6）。

图4 hsa-miR-146a-5p的预测靶基因个数Fig. 4 Predicted number of target genes of hsa-miR-146a-5p

图5 hsa-miR-146a-5p 预测靶基因所编码蛋白质间的相互作用分析Fig. 5 Protein-protein interaction network of the target genes of hsa-miR-146a-5p

2.6 hsa-miR-146a-5p预测靶基因的KEGG通路分析

以人类全基因组为背景基因，利用KOBAS数据库进行KEGG信号通路富集分析。Top 10 KEGG结果表明，hsa-miR-146a-5p 靶基因主要富集在Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号通路、核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、视黄酸诱导基因I样受体（retinoic acid-inducible gene I like receptors，RLRs）信号通路中，以及包括病毒性乙肝、丙肝、疟疾等疾病的相关通路中（P＜0.05）（图7）。

图6 hsa-miR-146a-5p 靶基因的GO注释分析Fig. 6 GO function analysis of hsa-miR-146a-5p target gene

图7 hsa-miR-146a-5p靶基因的KEGG通路富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miR-146a-5p target gene

3 讨论

近年来，hsa-miR-146a-5p在癌症、炎症中的差异表达已经得到广泛的研究［14-19］，它是一种多效调节因子，但在一系列癌症、炎症反应中的作用尚未完全被人们了解［20-21］。目前，也缺乏对hsa-miR-146a-5p 潜在靶点和相关功能通路的全面分析。生物信息学能够快速预测miRNA靶基因，同时将数据库预测的靶基因取交集，具有更好的可靠性。在本研究中，我们不仅探讨了hsa-miR-146a-5p的预期靶标集，还对其相关的富集功能进行了分析研究。

本研究分析发现miR-146a-5p的成熟序列在16个不同物种之间高度保守，推测hsa-miR-146a-5p可能具有重要的生物学功能，在机体中进行相关基本生理活动。同时，韦恩图交集得到总共73个hsa-miR-146a-5p的靶基因，靶基因富集于细胞，包括细胞器、细胞膜及附近区域等14个细胞组分中。hsa-miR-146a-5p的靶基因显著富集在机体代谢、炎症刺激的免疫系统反应、信号传导、发育过程以及正向或负向调控生物学等过程；同时，其也显著富集在TLRs信号通路、NF-κB信号通路、RLPs信号通路等通路中。TLRs和RLPs是关键的先天免疫模式识别受体，一些研究发现miR-146a-5p能通过TLRs通路途径诱导炎症反应。例如Xu等［22］发现宿主细胞的miR-146a-5p能够通过TLR7-MyD88介导细胞因子的产生；Feng等［23］运用miRNA芯片证实miR-146a促使白细胞的迁移；Hou等［24］揭示miR-146a在病毒感染过程中被上调，通过靶向TRAF6和IRAK1/2抑制视黄酸诱导基因I（retinoic acidinducible gene I，RIG-I）依赖性抗病毒信号途径；Zhu等［25］和Meng等［26］在口腔癌、胰腺癌等临床研究中证实了miR-146a-5p/NF-κB轴的重要调节机制。此外，miR-146a-5p对促进乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的复制有积极影响，具有诱导肝损伤和癌变的发生风险［27-28］。特别是Van Loon等［29］报道miRNA-146a参与了针对疟疾的先天免疫，推测它具有可能成为药物靶标的潜力。

然而，hsa-miR-146a在不同类型肿瘤中异常表达的功能机制仍然不清楚。尽管Forloni等［30］揭示了miR-146a在黑色素瘤中高度上调可以促进肿瘤发生 ；Zhang等［31］报道miR-146a-5p在肝细胞癌中被下调并起抑癌的作用；而Huang等［32］在非小细胞肺癌研究中称miR-146a-5p过表达能够抑制癌血管生成和肿瘤的发生。另几项研究还表明［33-34］，miR-146a能够通过NF-κB信号途径抑制肿瘤扩散。但迄今为止，学者对hsa-miR-146a-5p的功能仍知晓甚少，因为人类中存在超过30%的基因受miRNA调控，其中miR-146a可以靶向数百个miRNA，并且能够影响参与功能相互作用途径的许多基因的表达，这种影响机制还有待进一步研究。

综上所述，本文综合运用生物信息学数据库，预测和分析hsa-miR-146a-5p的保守性、GO注释分析以及KEGG通路富集分析等方面，从而进一步探讨hsa-miR-146a-5p在肿瘤发生、免疫应答及炎症等中的潜在分子机制，为治疗慢性炎症、疟疾、恶性肿瘤等疾病开辟了新的前景，对临床治疗的新疗法提供了理论基础。