微生态制剂对小鼠溃疡性结肠炎的作用

陈岩勤 李玉桂 杨盛刚 王聪 高秀丽,2,3

(贵州医科大学 1药学院，贵州 贵阳 550025；2微生物与生化药学工程中心；3药用植物功效与利用国家重点实验室)

溃疡性结肠炎(UC)是一种以腹痛、腹泻、便血等为特征的易复发性炎症性肠病〔1〕，近几年尤其是在亚洲，南美和中东地区其发病率持续上升〔2,3〕。迄今UC尚缺乏有效的药物来治愈，研究者认为UC的病因和发病机制与遗传因素、环境因素、肠道菌群和异常免疫反应等多种因素有关〔4〕。 UC患者与正常人群相比肠道中条件致病菌数量明显增多，而且双歧杆菌、乳酸菌等肠道正常菌群的数量明显下降〔5,6〕。秦广大等〔7〕将枯草杆菌和屎肠球菌(美常安)与青春双歧杆菌(丽珠肠乐)分别与柳氮磺胺吡啶联用治疗30例轻中度活动期UC患者，结果表明使用柳氮磺胺吡啶联合微生态制剂用于轻中度活动期UC的临床疗效优于单独使用柳氮磺胺吡啶。房玉海〔8〕将美沙拉嗪与美常安联合运用治疗94例UC患者1个月，结果表明不良反应相对较少。另有研究表明中药小檗碱通过调节肠道菌群〔9〕和调节免疫应答〔10～14〕对UC具有良好的疗效。本课题组通过建立与人类UC相似的葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导动物UC模型，探讨微生态制剂治疗UC的作用效果，为后续微生态制剂的实验研究和临床合理应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 70只SPF级雌性昆明小鼠，由贵州医科大学实验动物中心提供，体重(20±2.0)g，动物合格证号：SYXK(黔)2018-0001。

1.1.2药物、试剂及仪器 DSS(上海翊圣生物科技有限公司，D9606)；柳氮磺胺吡啶(上海福达制药有限公司，22160610)；盐酸小檗碱片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，2160929)；乳酸菌(商品名：聚克，江苏美通制药有限公司，170617)；枯草杆菌(商品名：枯草杆菌，华润紫竹药业有限公司，53160601)；地衣芽孢杆菌(商品名：地衣芽孢杆菌，东北制药集团沈阳第一制药有限公司，201706100)；白细胞介素(IL)-17A(037864)、IL-6(002293)、IL-10(002285)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(002095) 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。酶标仪(RT-6100)由Rayto公司生产；TG16W 微量高速离心机由三和仪器源头厂家生产；石蜡切片机由LEIKA公司生产；HT-200 恒温摇床源于赫田仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1模型动物分组 小鼠适应性喂养1 w，随机抓取分组，每组10只，分为对照组、模型组、柳氮磺吡啶组、小檗碱组、乳酸菌组、枯草杆菌组、地衣芽孢杆菌组。动物实验遵循贵州医科大学实验动物伦理委员会章程。

1.2.2造模及用药 对照组自由饮用无菌蒸馏水，每日同时间点给予生理盐水，灌胃体积0.2 ml/10 g，连续灌服7 d；模型组自由饮用3.5%DSS水溶液，每日同时间点给予生理盐水，灌胃体积0.2 ml/10 g，连续灌服7 d；柳氮磺胺吡啶组自由饮用3.5%DSS水溶液，每日同时间点按100 mg/kg、0.2 ml/10 g剂量连续灌服7d柳氮磺胺吡啶药物；小檗碱组自由饮用3.5%DSS水溶液，每日同时间点按15 mg/kg，0.2 ml/10 g剂量连续灌服7 d小檗碱；乳酸菌组自由饮用3.5%DSS水溶液，每日同时间点按33 mg/kg，0.2 ml/10 g剂量连续灌服7 d乳酸菌；枯草杆菌组自由饮用3.5%DSS水溶液，每日同时间点按30 mg/kg，0.2 ml/10 g剂量连续灌服7 d枯草杆菌；地衣芽孢杆菌组自由饮用3.5%DSS水溶液，每日同时间点按25 mg/kg，0.2 ml/10 g剂量连续灌服7 d地衣芽孢杆菌。

1.2.3疾病活动指数(DAI)评分 每日记录小鼠体重，观察腹泻情况、大便性状及便血状况，参照评分系统〔15〕，进行疾病活动指数评估。

1.2.4ELISA检测血清IL-17A表达水平 依照ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.5结肠IL-6、IL-10、TNF-α水平含量测定 取0.2 g结肠，加入5 ml生理盐水用匀浆器匀浆充分，然后以3 000 r/min离心10 min，收集上清液，检测具体操作依照说明书进行。

1.2.6结肠形态观察 取处死小鼠整段结肠，测量长度并做记录，观察各组小鼠结肠形态：黏膜是否光滑完整，有无糜烂、溃疡、水肿等现象。

1.2.7结肠苏木素-伊红(HE)染色观察 用预冷生理盐水将结肠洗净，于结肠末端(距肛门1 cm)处剪取0.5 cm长结肠，10%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片，采用HE染色法染色，光镜下观察。

1.3数据处理 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1DAI评分情况 饮用3.5%DSS溶液的各组小鼠第2天大便开始偏润，活动量与饮水量均减少。随实验天数增加，模型组症状逐渐加剧，几乎出现血便或隐血现象；7 d后各组腹泻发生率、便血率均比模型组低，其中小檗碱组和乳酸菌组腹泻发生率和便血率最低，地衣芽孢杆菌组介于之间。见表1；DAI评分结果见表2，与模型组比较用药组均有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组小鼠腹泻率、便血率(%)

2.2血清IL-17A测定结果 模型组血清IL-17A含量明显高于使用各种药物干预的治疗组(P<0.05)。见表2。

2.3小鼠结肠组织IL-6、IL-10、TNF-α测定结果 柳氮磺胺吡啶组、小檗碱组、乳酸菌组、枯草杆菌组、地衣芽孢杆菌组的细胞因子IL-6、TNF-α含量较模型组均明显下降(P<0.05)，而IL-10含量水平明显上升(P<0.05)。 见表2。

表2 各组小鼠DAI评分、IL-17A水平、结肠长度及结肠组织IL-6、IL-10、TNF-α含量水平比较

2.4各组结肠形态、长度及病理观察 图1可见，对照组小鼠结肠黏膜完整、光滑，没有出现糜烂或者溃疡现象，没有明显损伤，而模型组损伤现象较严重，乳酸菌组、小檗碱组出现糜烂或溃疡现象相对较少。模型组较其他组结肠更细，结肠中已无成形粪便；对照组结肠长度较其他组都长，且粪便成形，说明该批次小鼠无健康问题，柳氮磺胺吡啶组、小檗碱组、乳酸菌组、枯草杆菌组、地衣芽孢杆菌组结肠长度与模型组比较显著更长(P<0.05)。 见表2。

图2可见，对照组结肠黏膜完整、连续，无炎症细胞和溃疡形成；模型组结肠黏膜不完整，有溃疡形成，腺体排列无序，隐窝缺失并出现大量炎性细胞；其他组经过药物干预后炎性细胞相对减少，溃疡严重程度降低，腺体破坏程度较轻，黏膜结构较完整，治疗效果较好；其中乳酸菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌组别结肠状况与柳氮磺吡啶组状况相仿，但优于小檗碱组。

图1 用药后各组结肠大体形态

图2 各组结肠组织病理学形态(HE,×100)

3 讨 论

UC病因可能与肠道微环境、饮食、遗传、免疫等多重因素导致易感性机体对肠道黏膜抗原免疫应答失调有关，但其发病机制尚未完全清楚。根据炎性因子失衡是导致UC肠道炎症发作的重要环节，肠道菌群失调亦会引起多种消化道炎症性疾病〔16〕；庄鑫〔17〕通过调节患者免疫功能，控制炎性因子水平，抑制肠道炎症，改善肠道菌群环境，减轻肠黏膜细胞损伤，改善肠道功能。本研究用不同的微生态制剂进行干预发现其对与UC的治疗具有良好的效果。促炎因子与抗炎因子之间的平衡与UC的发病机制亦有关联〔18〕。TNF-α由激活的单核巨噬细胞产生，在炎症反应中促使其他细胞因子释放，形成细胞因子网络，扩大炎症连锁反应；IL-6由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，能刺激巨噬细胞或单核细胞、淋巴细胞等合成前列腺素、细胞因子、血小板激活因子等炎性介质，是一种作用广泛的促炎细胞因子〔19〕。IL-17A属于促炎因子，由Th17细胞产生，能够对UC的发生起调控作用〔20,21〕，随着UC发病程度的加剧，IL-17A的含量持续增加〔22,23〕。UC病程发展，IL-6和TNF-α含量均随着增高〔24,25〕。IL-10作为抗炎因子，由Th2细胞、单核-巨核细胞、B细胞分泌，研究表明IL-10含量水平的提高能有效减轻炎症反应，益生菌或其代谢产物可能会通过促进IL-10表达，使其IL-10表达水平增高来达到治疗UC的目的〔26,27〕。王旭霞等〔28〕研究发现，双歧杆菌能经过抑制细胞因子分泌来降低肠道通透性从而对肠道黏膜起保护作用。黎莉等〔29〕研究发现降低TNF-α、IL-6含量能起到治疗UC的作用，有助于结肠黏膜愈合。徐毅晖等〔30〕研究发现人促红素能减少Th17分化生成IL-17A达到治疗UC的目的。本研究显示微生态制剂可以降低TNF-α、IL-6、IL-17A分泌水平，提高IL-10含量，并有助于维持肠黏膜上皮细胞的完整，保持肠黏膜屏障功能。