骨碎补总黄酮对骨代谢的影响及作用机制

张朝栋，曹芹芹，徐婷婷，林露茜，岳 珂，郑晶晶，黄淑成

（河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450002）

骨碎补又称毛姜、崖姜，为水龙骨目骨碎补科骨碎补属附生蕨类植物根茎。其性温而补，具有壮骨益肾、化瘀消痛功效［1］。 骨碎补含有主要活性成分——骨碎补总黄酮，该物质具有促进骨形成、抑制骨吸收、促进骨骼血管生成、抑制炎症反应等作用［2］。 近年来，骨碎补总黄酮在治疗骨缺损及骨折愈合、膝关节骨性关节炎、骨质疏松和牵张成骨方面取得一定进展， 但对骨骼疾病潜在作用以及分子调控机制还存在很多未知因素，仍需深入研究。笔者就骨碎补总黄酮对骨代谢的影响及其作用机制进行综述。

1 骨碎补总黄酮对骨组织及血管的影响

骨组织形态计量学是一种骨组织定量研究方法，主要通过对显微镜下骨组织二维平面的测量，根据体视学原理，推测或转换获得三维参数，包括静态参数和动态参数［3］。 骨体积分数是骨组织体积与组织体积的比值， 是检测骨量变化状况的重要指标。骨小梁厚度指骨小梁的平均厚度，其变化可影响骨量，在一定条件下，骨小梁的厚度越大，代表其骨量越多，抵御外力、受到损害后恢复的能力越强［4］。 骨小梁间距指骨小梁之间的平均距离。骨碎补总黄酮可增加骨体积分数， 提高骨小梁厚度，减少骨小梁间距，改善骨三维结构，从而增强骨密度，改善骨矿化。 另外，还可通过抑制胫骨干骺端组织蛋白酶K （cathepsin K）mRNA 表达量抑制破骨细胞的骨吸收， 从而提高胫骨干最大弯曲载荷增加骨骼强度。

骨是一种高度血管化的组织， 依靠血管系统的血液和营养供应维持骨骼的正常生长、 维护和重塑。骨组织中的血管系统除了是输送氧气、营养物质、新陈代谢的管道系统，还为骨祖细胞的自我更新提供微环境以及为骨髓内的造血干细胞提供细胞来源和滋养环境［5］。 一些细胞因子相互协调、相互作用是骨骼形成和稳定的重要依靠。 血管分泌因子和血管生成因子相互联系、相互作用，共同协调骨微环境的细胞间联系， 以及血管生成与成骨的耦合［6］。 血清内皮素（ET）对血管起收缩作用，血管内皮舒张因子（NO）可使血管舒张，微血管循环是否稳定取决于二者动态平衡，若平衡打破，微血管循环受损，从而影响骨代谢。骨碎补总黄酮具有维持ET/NO 平衡的能力，从而促进血管内皮细胞增殖［7］。 骨碎补总黄酮可促进血管生长因子VEGF 表达，从而促进局部血管生成，进而影响骨形成［8-9］。 由此可知，骨碎补总黄酮可通过促进骨组织局部血管生成改善骨质强度。

2 骨碎补总黄酮对骨细胞的影响

2.1 骨碎补总黄酮对成骨细胞的影响

成骨细胞是骨基质的合成、 分泌与矿化过程中重要的物质基础。 成骨细胞在其细胞增殖期数量增加，成骨细胞相互堆叠，构成一个多层结构，合成并分泌成骨相关蛋白，最终矿化成骨［10］。骨碎补总黄酮可促进成骨细胞的增殖、成熟与分化，提高处于S 期的细胞比例， 以及抑制细胞发生早期凋亡， 还可对成骨增殖及基质成熟相关基因的表达进行调控，如骨形态发生蛋白2（BMP-2）、骨形态发生蛋白6（BMP-6）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、骨桥素（OPN）［11-12］。因此，骨碎补总黄酮可通过调控成骨细胞的增殖分化以及相关基因的表达促进骨的形成。

2.2 骨碎补总黄酮对破骨细胞的影响

破骨细胞是由来自骨髓中高度分化的巨噬细胞形成的多核细胞， 通过复杂的分子生物机制介导骨吸收，破骨细胞、淋巴细胞与巨噬细胞三者相互作用，分泌多种细胞因子，调控某些细胞活性，从而影响骨吸收与骨形成［13］。有研究表明，骨碎补总黄酮可通过提高半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）及细胞色素C 的表达，抑制B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达，抑制破骨细胞增殖分化及其活性，从而实现对破骨细胞凋亡的调控［14］。由此可见， 骨碎补总黄酮不仅具有促进成骨细胞增殖分化的作用， 还可通过调控破骨细胞凋亡相关基因的表达起到抑制骨吸收的作用。

2.3 骨碎补总黄酮对软骨细胞的影响

软骨细胞是软骨中存在的唯一细胞， 在软骨代谢、细胞外基质的合成与更新、维持基质完整过程中，软骨细胞发挥重要作用［15］。骨碎补总黄酮可以调控促进细胞凋亡的Bax 蛋白、 抑制细胞凋亡的Bcl-2 蛋白、 抑制凋亡执行因子Caspase-3，从而抑制软骨细胞凋亡； 骨碎补总黄酮可提高软骨细胞活性，促进其增殖分化从而影响骨代谢［16-17］。由此可见， 骨碎补总黄酮对软骨细胞的调控与其对破骨细胞的调控相似， 都是对细胞凋亡相关基因的调控。

3 骨碎补总黄酮影响骨代谢的分子作用机制

3.1 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt/β-catenin 信号通路是骨代谢中发挥关键作用的信号通路之一，是骨骼生长发育、调节骨稳态的重要信号通路［18］。 胞质内散乱蛋白（Dsh）、核内转录因子TCF/LEF 家族、 分泌蛋白Wnt 家族、跨膜受体Frizzled 家族、 酪蛋白激酶1 与Axin 蛋白、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、激活蛋白C、β-连环蛋白（β-Catenin）是Wnt/β-catenin 信号通路重要成分。 分泌型配体蛋白Wnt 特异性结合膜表面受体蛋白Fzd， 活化胞内蛋白Dsh 蛋白，Dsh 蛋白与受体相互作用与一些胞质蛋白的相互作用使β-catenin 逐渐在胞浆内累积，与胞核内TCF/LEF转录因子家族联系，从而激活下游靶基因的转录，并发挥其生物学效应［19-20］。

Wnt/β-catenin 信号通路可通过调控成骨细胞增殖分化、矿化及凋亡影响骨代谢，从而促进骨形成［21-22］。Wnt 蛋白可通过与Fzd、LRP5/6 结合，降低GSK-3β 蛋白活性，使β-catenin 处于稳态，而βcatenin 可调控下游TCF/LEF 促进骨细胞成熟分化。 Runx2 蛋白可调控骨髓间充质干细胞（BMSC）向成骨细胞的分化过程， 并对成骨细胞增殖成熟进行调控，进而调控软骨内和膜内成骨进程。该信号通路还可通过促进β-catenin 的表达，激活下游基因Runx2 的表达，进而促进BMSC 分化为成骨细胞，从而促进骨形成、修复骨缺损［23-24］。 有报道发现，骨碎补总黄酮可通过调控BMP-2 的表达激活Wnt/β-catenin 信号通路使早期BMSC 增殖、分化、成熟，促进骨形成［25］。 骨碎补总黄酮可增加Wnt/β-catenin 信号通路中TCF/LEF 转录因子、βcatenin、Runx2 及Osteriex 的表达， 抑制GSK-3β的表达使血清碱性磷酸酶（ALP）含量上升，进而促进骨形成［26］。 骨碎补总黄酮可通过增加骨膜蛋白的表达， 抑制硬化蛋白的表达， 激活Wnt/βcatenin 信号通路进而影响成骨细胞的成熟与分化［27］。 因此，骨碎补总黄酮可通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞的成熟分化， 进而促进骨形成。

3.2 OPG/RANKL/RANK 信号通路

OPG/RANKL/RANK 信号通路在破骨细胞成熟、骨建模以及骨重建中具有重要作用。破骨细胞核因子-κB（RANK）、核因子-κB 受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）是该信号通路主要成分。 RANKL 由成骨细胞分泌，可活化RANK，并由破骨细胞及其前体表达；RANKL 可调控破骨前细胞成熟分化， 并在之后破骨细胞的激活与维持中发挥作用；OPG 由成骨细胞和成骨基质干细胞分泌， 可与RANKL 特异性结合， 从而达到与RANK 竞 争RANKL 的 目 的， 降 低RANKL 与RANK 的结合率， 从而降低因过度骨吸收造成的骨骼损伤［28-29］。OPG 与RANKL 的表达量是骨代谢中骨质量和骨强度的重要决定因素， 且RANKL/OPG 比例失衡可能导致过度的骨吸收。 成骨细胞可通过控制OPG 与RANKL 的表达量间接调控破骨细胞，以达到成骨细胞与破骨细胞耦联的目的，破骨细胞可通过RANK 与RANKL 的特异性结合，促进破骨细胞成熟分化［30］。 研究发现，骨碎补总黄酮可以协同1α，25-二羟基维生素D3促进成骨细胞、 破骨细胞以及骨髓间充质干细胞中OPG的表达， 提高血清中OPG 的含量， 改变OPG/RANKL 的比例，抑制破骨细胞的增殖、成熟、分化与活力，同时抑制破骨细胞的骨吸收功能，从而对骨形成进行调控［31-32］。 因此，骨碎补总黄酮可通过OPG/RANKL/RANK 信号通路调节破骨细胞的分化机制，抑制骨吸收，促进骨形成。

3.3 BMP-Smads 信号通路

研究发现骨碎补总黄酮不仅参与Wnt/βcatenin 信号通路的调节促进成骨细胞的成熟分化，还可以通过调节BMP-Smads 信号通路发挥促进成骨细胞增殖分化的功能。 BMP-Smads 信号通路可通过促进成骨细胞增殖分化和矿化细胞质基质影响骨代谢。

骨形态发生蛋白（BMP），是TGF-β 家族中一种高度保守且具有高度相似结构的功能蛋白。BMP 可通过促进BMSC 分化为成骨细胞并产生骨与软骨形成相关因子， 从而对骨骼的生长发育与再生修复发挥重要作用。 BMP 可通过激活Smads信号转导发挥成骨作用，TGF-β 由Smads 蛋白家族传导，TGF-β/激活素信号由Smad2 和Smad3 传导，Smad1、Smad5、Smad8 和Smad9 调 节BMP 信号转导，Smads 蛋白家族可将TGF-β 信号由细胞膜传至细胞核，BMP 激活Smads 信号，随后激活细胞核内成骨细胞特异性转录因子核心结合蛋白因子2（Runx2）及成骨细胞特异性转录因子（Osterix）等靶基因的表达，随后促进成骨细胞成熟分化［33-34］。骨碎补总黄酮通过调控血清中BMP-2 和骨髓微环境中Smad1、Smad5、Smad8 mRNA 的表达水平，提高BMP-2 的分泌水平， 激活BMP-Smads 信号通路相关成骨基因Runx2 和Osterix 表达，从而实现对骨形成的调控。其主要作用体现在两方面，一方面可促进BMSC 向成骨细胞分化； 另一方面也可促进成骨细胞分化成熟，对骨骼生长发育、再生修复、提高骨密度发挥重要作用［35-37］。 另外，柚皮苷作为骨碎补总黄酮的主要成分， 也可通过Akt的磷酸化和AP-1 的组件c-fos 和c-jun 的激活促进BMP-2 的表达，从而发挥成骨作用［38］。 由此可见， 骨碎补总黄酮及其主要成分柚皮苷均有调节BMP-Smads 信号通路促进成骨细胞增殖分化相关基因表达的作用。

3.4 MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路

MAPK 信号通路是促进成骨细胞增殖分化与矿化的主要通路，它是一种保守的三级激酶模式，该信号通路由MAPK 激酶激酶（MKKK）、MAPK激酶（MKK）和MAPK 构成，三种激酶可依次激活，进而对成骨细胞进行调控。 MAPK 信号通路又可分为细胞外信号调节蛋白激酶 （ERK） 信号通路、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38）信号通路、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信号通路。ERK 信号通路可调控ALP 的表达，进而影响成骨细胞的增殖分化与矿化及其细胞功能。与此同时，该信号通路通过促进BMSC 分化为成骨细胞，在维持骨骼结构的稳态方面也发挥着重要作用。 p38 信号通路与JNK 信号通路对成骨细胞的增殖分化与矿化的调控主要通过BMP 蛋白与氧化应激活化完成，而且p38 信号通路可促进ALP 的表达，JNK 信号通路在成骨细胞分化后期发挥作用［39-40］。 有研究表明， 骨碎补总黄酮可作用于成骨细胞的ERK受体，成为激活ERK 信号通路的第一信号，促进成骨细胞ALP 的表达，进而对成骨细胞增殖分化与矿化进行调控［41］。 骨碎补总黄酮可调控成肌细胞向成骨细胞分化的过程， 提高核结合因子a1和ALP mRNA 的表达，而核结合因子a1 和ALP 是p38 信号通路的主要参与因子，所以，骨碎补总黄酮可通过p38 信号通路对骨代谢进行调控［42］。JNK 磷酸化水平升高， 可抑制成骨细胞增殖分化，骨碎补总黄酮可抑制JNK 的磷酸化，促进成骨细胞的增殖分化，减少其凋亡［43］。 因此，骨碎补总黄酮可通过MAPK 信号通路促进成骨细胞增殖分化，发挥成骨作用。

3.5 CTSK 信号通路

CTSK 信号通路是一种通过促进骨胶原纤维的降解促进骨吸收的信号通路。 溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶K（CTSK）是破骨细胞主要的蛋白酶，CTSK 参与破骨细胞分化的全过程，主要作用在于对骨有机基质的降解以及调控破骨细胞的凋亡。CTSK 对Ⅰ型胶原等骨有机基质的降解是通过其在成熟的破骨细胞中以酶原形式合成并裂解活化发挥的作用。 因此，通过抑制CTSK 信号通路，可减少骨有机质的降解，抑制骨吸收，而且对骨形成无明显影响。 骨碎补总黄酮通过该信号通路影响骨代谢的机制与类雌激素相同， 通过减少血清中CSTK 的含量，抑制胫骨干骺端CTSK mRNA 的表达， 从而抑制破骨细胞的生成及其对骨有机基质的降解作用［44-45］。 结果表明，骨碎补总黄酮可通过CTSK 信号通路对破骨细胞进行调控，抑制破骨细胞对骨有机基质的降解。

3.6 Notch 信号通路

Notch 信号通路是一条高度保守的重要信号通路，Notch 调节分子、Notch 受体、Notch 配体及CSLDNA 结合蛋白是该信号通路的主要成分。 其在机体的分化与成熟中发挥重要作用。 该通路Notch 配体与Notch 受体特异性结合后，Notch 信号通路激活，进而激活其下游靶基因Hes-1 的转录。 Notch 对骨形成与骨吸收过程不是单一的促进或抑制作用， 而是多种调节因子参与的双向调节。 在骨骼发育过程中，Notch 信号通路可以通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化与成熟参与软骨的形成［46］。有研究表明，骨碎补总黄酮可以通过下调骨髓间充质干细胞中受体Notch-1及下游靶基因Hes-1 mRNA 的表达， 进而抑制Notch 信号通路，促进成骨细胞增殖，改善成骨质 量［47］。

3.7 谷氨酸信号通路

在骨组织中， 谷氨酸信号通路的组成与中枢神经系统类似，由谷氨酸（Glu）、相关转运体、转运囊泡、受体、钙信号、环磷酸腺苷（AMP）信号的级联和Glu 代谢相关酶组成。 谷氨酸信号通路不仅参与成骨细胞的成熟分化， 还能对成骨祖细胞的分化进行调控。Glu 离子型受体的激活主要与钙信号有关，并由此触发各种钙—依赖酶的级联反应，导致各种细胞的生理变化， 离子型谷氨酸受体可通过激活Cbfa-1 促进成骨祖细胞分化， 促进骨形成， 也可通过激活核因子-κB 对破骨细胞的成熟分化与凋亡进行调控， 促进骨吸收。 有研究表明， 骨碎补总黄酮可显著提升代谢性谷氨酸受体mGluR5 的表达，也可降低血清中谷氨酸脱羧酶水平，减少股骨GABA 和GABABR1 的表达，从而加速骨形成［48-50］。 因此，骨碎补总黄酮可以通过提升谷氨酸信号通路中谷氨酸受体的表达对骨组织进行调控，从而促进骨骼强健。

4 结语

综上所述， 骨碎补总黄酮作为中药骨碎补中提取的主要活性成分， 通过大量的试验证实骨碎补总黄酮不仅可以提高骨密度， 增强骨骼机械强度，降低疼痛，还可通过促进血管内皮细胞增殖，促进骨骼局部血管形成，也可通过促进成骨细胞、软骨细胞增殖，破骨细胞凋亡，从而对骨骼的形成发挥作用。骨碎补总黄酮可通过Wnt/β-catenin 信号 通 路、OPG/RANKL/RANK 信 号 通 路、BMPSmads 信号通路、MAPK 信号通路、CTSK 信号通路、Notch 信号通路和谷氨酸信号通路促进骨形成，抑制骨吸收。 但是，骨碎补总黄酮作为治疗骨骼疾病的热门药物， 在对骨骼疾病潜在作用以及分子调控机制方面，仍需要研究。