广州地区0～7岁儿童血清25羟维生素D水平检测结果分析*

范雪莲，曾梓建，蔡志梁，张乔轩，石文，刘冬冬，林海标

(1.广州市海珠区妇幼保健院检验科，广州 510240；2.广东医科大学医学检验学院，广东东莞523808 3.广州中医药大学第二临床医学院，广州 510120)

25羟维生素D[25(OH)D]是固醇类衍生物，也是人体生长和发育过程中的必需元素。血液中25(OH)D的含量不仅在维持血清钙浓度稳定和骨骼健康方面起着重要的生理作用，还可作用于胰腺细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞以及免疫细胞等多种组织细胞。25(OH)D含量与呼吸系统疾病、心脑血管疾病、内分泌系统疾病、自身免疫病、肿瘤有关[1]。25(OH)D在体内的主要存在形式为25羟维生素D2[25(OH)D2)]和25羟维生素D3[25(OH)D3][2]，本研究采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3水平，可准确反映人体25(OH)D的营养水平[3-4]。研究表明[5]，不同地区人体血清25(OH)D水平存在差异。但未见广州地区相关报道，本研究通过对2 418例0～7岁儿童血清25(OH)D检测结果进行分析，初步了解广州地区0～7岁儿童血清25(OH)D营养状况。

1 对象和方法

1.1研究对象 选择2018年2月至2019年6月在广东省中医院健康体检的0～7岁儿童2 418例，其中男1 380例，女1 038例；季节划分为：春季，3～5月；夏季，6～8月；秋季，9～11月；冬季，12～次年2月。所有研究对象身心健康，营养状况良好，肝肾功能正常，排除患有遗传病、先天性疾病等基础疾病以及近1个月内有发热等症状的儿童。

1.2标本采集与处理 上午8:00—11:00采集研究对象空腹静脉血标本2～3 mL，2 h内离心分离血清，-20 ℃保存。

1.3主要仪器与试剂 Waters TQ-S串联ACQUITY UPLC液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司)，Agela Technologies氮气吹干器(天津博纳艾杰尔科技公司)，25(OH)D校准液为美国国家标准技术研究所(NIST)标准物质SRM 972a[25(OH)D2和25(OH)D3，溶剂型]和SRM 972a(4浓度水平，血清基质)。纯度为98.0%的25(OH)D3-23,24,25,26,27-13C5(99原子%13C)和纯度为99.3%的25(OH)D2-6,19,19-d3(99原子%13C)作为内标物(ISs)(美国Sigma-Aldrich公司)。LC-MS级甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯(德国MereK公司)。硫酸锌、甲酸(美国Sigma-Aldrich公司)。涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)，Eppendorf移液器(德国Eppendorf公司)，Thermo 高速冷冻离心机(美国Thermo 公司)，Simplicity UA超纯水机(美国Millipore公司)等。

1.425(OH)D检测及评价标准

1.4.1样本处理 分别取待测样本血清于15 mL离心管中并进行编号，然后分别加入10 μL内标工作液，涡旋混匀；往上述离心管中加入200 μL 0.2 mmol/L硫酸锌溶液，振荡混匀后室温静置10 min；加入500 μL甲醇震荡混匀，蛋白质沉淀后加入1 mL正己烷/乙酸乙酯(2∶1)涡旋震荡1 min后在4 000 r/min条件下离心10 min；各取900 μL上清液于新的离心管中，氮气吹干；往离心管中加入200 μL 50%乙腈水复溶，4 000 r/min离心5 min，取上清液至进样瓶中并编号，上机检测。

1.4.2标准曲线配制 分别取1、5、10、20、50和100 ng/mL标准品溶液于15 mL离心管中并进行编号，然后分别加入10 μL内标工作液，涡旋混匀，取200 μL上述溶液于进样瓶中并编号，上机检测。

1.4.3评价标准 用LC-MS/MS测量25(OH)D2和25(OH)D3水平，根据血清25(OH)D2和25(OH)D3总量判断维生素D营养状况,当25(OH)D水平<50 nmol/L(20 ng/L)为缺乏；50 nmol/L(20 ng/L)≤25(OH)D<75 nmol/L(30 ng/L)为不足；75 nmol/L(30 ng/L)≤25(OH)D为充足[6]。

1.5统计学分析 采用SPSS 24.0统计软件进行。用Kolmogorov-Smirnov test进行正态性检验。偏态分布的计量资料用M(P25，P75)描述；两独立样本的比较用Mann-WhitneyU检验；多个独立样本的比较先用Kruskal-WallisH检验，相邻组间两两比较用Mann-WhitneyU检验。计数资料用百分比表示，组间比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.10～7岁儿童血清25(OH)D的总体分布 2 418例0～7岁儿童血清25(OH)D水平为36.1(29.5，44.8)ng/L，其中缺乏组113例，占4.7%，不足组534例占22.1%，充足组1 771例，占73.2%，25(OH)D处于较低水平的占26.8%。见表1。

表1 2 418例0～7岁儿童血清25(OH)D的分布

2.20～7岁儿童血清25(OH)D水平的性别间差异 0～7岁儿童血清25(OH)D水平男性高于女性(Z=-2.352，P=0.019)，且男性缺乏和不足比例低于女性，充足比例高于女性，差异有统计学意义(χ2=9.591，P<0.05)。见表2。

表2 不同性别0～7岁儿童血清25(OH)D水平比较

2.30～7岁儿童血清25(OH)D水平的年龄间差异 0～7岁儿童血清25(OH)D水平随年龄增长呈下降趋势；3～4岁、4～5岁、5～6岁、6～7岁血清25(OH)D水平均低于0～1岁、1～2岁、2～3岁(P均<0.05)；除5～6岁和6～7岁组间差异无统计学意义外(P>0.05)，其他各相邻组间差异均有统计学意义(P均<0.05)；3～4岁、4～5岁、5～6岁、6～7岁血清25(OH)D缺乏和不足比例高于0～1岁、1～2岁、2～3岁，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同年龄0～7岁儿童血清25(OH)D水平比较

2.40～7岁儿童血清25(OH)D水平的季节间差异 0～7岁儿童夏季血清25(OH)D水平最高，冬季25(OH)D水平最低，春季和秋季比较差异无统计学意义(P>0.05)，其他各组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。冬季25(OH)D缺乏比例高于其他季节，夏季25(OH)D缺乏和不足比例最低，差异有统计学意义(P<0.05)；春、秋季节25(OH)D水平以及缺乏、不足的比例接近。见表4。

表4 不同季节0～7岁儿童血清25(OH)D水平比较

2.5不同年龄0～7岁儿童血清25(OH)D2的检出率 0～7岁儿童25(OH)D2共检出346例，检出率为14.3%，其中0～1岁儿童血清25(OH)D2检出率高于其他年龄段，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 0～7岁儿童血清25(OH)D2在不同年龄段的检出率[n(%)]

2.60～7岁儿童血清25(OH)D2对评价维生素D营养状况的影响 若仅采用血清25(OH)D3水平评价0～7岁儿童维生素D水平，缺乏率为7.2%，不足率为24.6%，而25(OH)D2的检出使0～7岁儿童总体维生素D充足比例共上升5%。分析346例检出25(OH)D2的结果，25(OH)D2使血清维生素D缺乏率降低了17.4%，不足率降低了17.3%，充足率提高34.6%。见表6。

表6 0～7岁儿童血清25(OH)D2对评价维生素D营养状况的影响

3 讨论

维生素D是人体正常发育必需的元素，其主要生理功能是维持血钙及血磷的正常浓度[7]。维生素D还参与生殖、免疫、内分泌等方面的调节[8]。维生素D缺乏目前在国内外儿童中比较普遍，严重危害儿童的身体健康[9-10]。本研究通过分析0～7岁儿童血清25(OH)D水平与性别、年龄、季节的关系，了解广州地区0～7岁儿童维生素D水平的营养现状，以期为科学防治儿童维生素D缺乏提供依据。

本研究结果表明，2 418例0～7岁儿童中维生素D缺乏和不足比例占26.8%，与报道[11]一致。男童维生素D总体水平高于女童，且缺乏比例低于女童。户外时间每天超过两小时是维持维生素D正常水平的保护性因素[12]，男童相较于女童，更愿意参与户外活动，进而提高了体内维生素D水平。不同年龄的儿童之间，维生素D水平存在一定的差异，0～7岁儿童血清25(OH)D水平随着年龄的增长呈下降趋势。可能原因为：0～3岁儿童通过补充维生素D或食入奶粉等相对3～7岁摄入量更多；而3～7岁儿童可能由于偏食、入学后户外活动减少、机体对维生素D的需求增大等。结果还表明0～7岁儿童25(OH)D水平受季节的影响，夏季最高，冬季最低，春季和秋季水平接近。夏季儿童户外接受紫外线照射的条件充足，而冬季儿童在户外时间短，导致维生素D生成较少。广州地区春秋季节不分明，可能受降雨的影响导致儿童户外时间减少而使得25(OH)D水平低于夏季。

25(OH)D2的检出对0～7岁儿童总体25(OH)D水平影响不大，仅使缺乏和不足比例共降低5%，但是在检出的人群中可明显减少25(OH)D的缺乏和不足比例。25(OH)D2的检出有助于临床精准判断25(OH)D营养状况并提供治疗方案。目前维生素D检测常用方法为免疫法和色谱法。免疫法在检测维生素D时，各种25(OH)D代谢产物和类似物都能利用抗原抗体结合的原理发生反应，故只能检测25(OH)D总的浓度，而不能区分25(OH)D2和25(OH)D3[13]。本研究采用的LC-MS/MS同时具备液相色谱的高分理性和质谱仪强大的分离鉴定能力，可区分25(OH)D2和25(OH)D3，对于医生干预补充25(OH)D2有重要意义。

综上所述，0～7岁儿童的维生素D水平与性别、年龄、季节有关。我们在临床实际工作中，应更加注重女童维生素D的补充，应加强对3～6岁儿童维生素D水平的重视，观察其饮食习惯和户外运动情况。在阳光不充足的季节，应该及时对儿童维生素D水平进行调查，补充适当的维生素D制剂，以满足身体需要。同时检测25(OH)D2和25(OH)D3，对于客观评价人体维生素D水平，营养状况的评估以及疾病的发现和预防等有重要的临床意义和社会价值。