LncRNA HOTAIR、VEGF在肾上腺恶性肿瘤组织中的表达及其预后相关性

杜学谦 孙青风 田龙江

1沧州市人民医院超声科，061000；2沧州市人民医院泌尿外科，061000

肾上腺肿瘤是泌尿外科常见的外科肿瘤，具有良性和恶性之分，恶性肾上腺肿瘤具有远处转移、包膜浸润等特点，患者预后生存率较低，恶性肾上腺肿瘤5年生存率大约为44%。目前研究发现长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)在转录、转录后等多层次都可对基因表达进行调控，在许多肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展及预后具有密切关系[1]。人类同源盒基因(homeobox，HOX)的反义RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)是第一个被发现的LncRNA，与HOXC基因簇共表达，在转录后层次调控多种基因的表达。有研究发现HOTAIR在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中表达水平上调，与肿瘤的良恶性、有无远处转移密切相关[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以参与血管生成，与肿瘤转移也密切相关。关于HOTAIR和VEGF同时在肾上腺肿瘤组织中表达与预后的关系研究较少，因此本研究检测肾上腺恶性肿瘤组织HOTAIR、VEGF的表达与临床病理特征及预后的关系，为评估肾上腺肿瘤患者预后提供理论依据。

资料与方法

一、临床资料

选取2014年1月至2017年1月于沧州市人民医院手术治疗切除的肾上腺标本167例，其中肾上腺恶性肿瘤101例(肾上腺恶性肿瘤组织)，良性肾上腺66例(良性肾上腺组织)。肾上腺恶性肿瘤组织患者，男58例(57.43%)，女43例(42.57%)；年龄范围40～80岁，年龄(59.96±10.06)岁。良性肾上腺组织患者，男36例(54.55%)，女30例(45.45%)；年龄范围40～80岁，年龄(60.11±10.16)岁。纳入标准：(1)患者术前未进行化疗、放疗及激素治疗；(2)患者临床资料完整、能够配合完成随访。排除标准：(1)并发其他恶性肿瘤患者；(2)合并自身免疫性疾病者；(3)肝、肾功能严重异常的患者。两组研究对象在性别、年龄上比较差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究通过沧州市人民医院伦理委员会批准(批准号：L102013019)，患者均知情同意。

二、方法

1.评分标准 所有组织均经2位有经验的医生进行病理诊断并根据Weiss评分[3]，Weiss评分≥3分诊断为肾上腺恶性肿瘤，Weiss评分<3分诊断为肾上腺良性肿瘤。

2.治疗方法 肾上腺肿瘤患者行腹腔镜手术治疗。肾上腺恶性肿瘤患者手术切除肿瘤后一个月，行辅助治疗或化疗。化疗药物选用密妥坦，使用方法依据临床常规使用疗程。

3.主要试剂及仪器 TRIzol(货号：15596-026)，武汉科昊佳生物科技有限公司；RNA SYBR Green PCR Kit(货号：KL101-969)，上海康朗生物科技有限公司；第一链cDNA耐热反转录试剂盒(货号：KL268)，上海康朗生物科技有限公司；CFX96实时荧光定量PCR仪，德国Bio-Rad公司。

4.样品采集 所有行手术治疗切除的肾上腺良、恶性患者入院手术时均留有病理组织(3 cm×3 cm)，组织于液氮中速冻，之后冻存于-80 ℃冰箱中待测。

5.荧光定量PCR检测组织中HOTAIR、VEGF mRNA的表达 使用TRIzol试剂提取肾上腺恶性肿瘤组织和良性肾上腺组织中总RNA，采用分光光度计检测RNA纯度，挑选RNAOD260/OD280约为1.8～2.0的样品用于互补DNA反转录及实时荧光定量反转录PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR)，依据反转录试剂盒操作步骤逆转录得到互补DNA，以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，采用CFX96实时荧光定量PCR仪对HOTAIR、VEGF mRNA及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行扩增反应。反应条件：95℃，3 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s；40个循环；72℃，3 min。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算HOTAIR、VEGF mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

三、随访

所有肾上腺恶性肿瘤患者术后均接受随访，通过电话或复诊的方式对所有患者均进行3年随访，患者开始治疗时即开始随访，统计随访期间死亡例数及对应死亡时间(本研究中患者死亡皆与本病有关)，本次随访截止日期2020年1月。

四、统计学方法

采用SPSS 25.0软件对数据进行分析，计数资料用例(%)表示，采用χ2检验。本研究数据符合正态分布，计量资料以Mean±SD表示，组间数据符合方差齐性，两组间比较行独立样本t检验。Pearson法分析HOTAIR与VEGF的相关性。采用Kaplan-Meier对肾上腺恶性肿瘤患者3年的生存情况进行分析。用COX法分析影响肾上腺恶性肿瘤患者预后的因素。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、肾上腺恶性肿瘤组织和良性肾上腺组织HOTAIR、VEGF mRNA表达水平比较

与良性肾上腺组织相比，肾上腺恶性肿瘤组织HOTAIR、VEGF mRNA相对表达水平较高(P<0.05)。(表2)

表2 肾上腺恶性肿瘤组织和良性肾上腺组织HOTAIR、VEGF mRNA表达水平比较

二、HOTAIR与VEGF相关性分析

Pearson分析显示，HOTAIR与VEGF呈正相关(r=0.739，P<0.05)。(图1)

图1 HOTAIR与VEGF的散点图

三、HOTAIR、VEGF mRNA表达水平与肾上腺恶性肿瘤患者临床病理特征的关系

将HOTAIR平均值(4.96)作为分界线，肾上腺肿瘤患者高于4.96分为高表达组共56例，低于4.96为低表达组共45例，将VEGF mRNA平均值(3.54)作为分界线，肾上腺肿瘤患者高于3.54分为高表达组共59例，低于3.54为低表达组共42例。结果显示HOTAIR、VEGF mRNA与癌细胞发生远处转移有关(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤单发或多发无关(P>0.05)。(表3、4)

表3 HOTAIR表达水平与肾上腺肿瘤患者临床病理特征的关系

表4 VEGF mRNA表达水平与肾上腺肿瘤患者临床病理特征的关系

四、HOTAIR、VEGF mRNA表达水平与肾上腺恶性肿瘤患者预后的关系

Kaplan-Meier法显示HOTAIR低表达肾上腺恶性肿瘤患者的生存时间为(32.09±0.92)个月，显著长于HOTAIR高表达肾上腺恶性肿瘤患者(21.64±1.49)个月，Log Rank检验，χ2=20.916，P<0.01(图2)。VEGF mRNA低表达肾上腺恶性肿瘤患者的生存时间为(31.81±0.97)个月，显著长于VEGF mRNA高表达肾上腺恶性肿瘤患者(22.37±1.47)个月，Log Rank检验，χ2=14.849，P<0.01。(图3)

图2 HOTAIR表达水平与肾上腺恶性肿瘤患者预后的函数

图3 VEGF mRNA表达水平与肾上腺恶性肿瘤患者预后的函数

五、影响肾上腺恶性肿瘤患者预后的危险因素分析

单因素分析表明，癌细胞有无远处转移、HOTAIR高表达、VEGF高表达均是影响肾上腺恶性肿瘤患者不良预后的危险因素。多因素分析表明，癌细胞远处转移、HOTAIR高表达、VEGF高表达是影响肾上腺恶性肿瘤患者不良预后的独立危险因素(P均<0.05)。(表5、6)

表5 肾上腺肿瘤患者临床资料的变量赋值

讨 论

LncRNA是一类长度超过200 nt的单链RNA，由RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物。近年来发现LncRNA是在肿瘤中具有特异性表达，可参与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等，从而调控肿瘤的发生、发展[4-5]。HOTAIR位于人体第12号染色体HOXC簇中HOXC11和HOXC12之间的基因间区域[6]。文献报告HOTAIR可通过多种方式参与细胞基质的调节，例如沉默基因表达、结合染色质修饰酶等[7]。有文献报告HOTAIR在上皮癌细胞中过表达可使哺乳动物多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)相关基因在细胞内重新定位，促使细胞发挥胚胎纤维细胞的类似的功能，抑制H3组蛋白第27位赖氨酸(H3K27)发生甲基化，进而提高肿瘤细胞侵袭和转移能力[8]。王慧霄等[9]文献报告HOTAIR可聚集PRC2促使H3K27发生甲基化，另外HOTAIR 5′端可与PRC2结合，然后介导PRC2沉默相关抑癌基因的转录，进而导致乳腺癌的复发及癌细胞转移。叶岭等[10]研究发现HOTAIR在宫颈癌组织中表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞，HOTAIR高表达可能对宫颈癌细胞生长、迁移具有促进作用。刘泓键等[11]研究发现HOTAIR 在膀胱癌细胞表达水平呈上调，沉默HOTAIR表达可抑制膀胱癌细胞增殖并促进其凋亡，猜测HOTAIR可能通过调控Notch信号通路发挥对肿瘤细胞的调控作用。本研究发现肾上腺恶性肿瘤组织HOTAIR相对表达水平显著高于良性肾上腺组织，临床病理特征分析HOTAIR与肿瘤直径、肿瘤良性或恶性、有无远处转移相关，提示HOTAIR可能影响肾上腺恶性肿瘤的发生、发展，相关文献报道提示HOTAIR可能通过调控相关抑癌基因的转录，从而影响肿瘤的增殖、迁移等[10-11]。

表6 影响肾上腺恶性肿瘤患者预后的危险因素分析

VEGF是血管生成的重要调控因子，能直接诱导血管内皮细胞增殖和血管腔形成。近年来有很多文献报告VEGF与肿瘤的发生、癌细胞浸润及转移有密切关系，其作用机制是通过促进肿瘤血管生成，增加血管壁的渗透性，从而促进肿瘤细胞的增殖[12-13]。蒋艳霞等[14]研究发现VEGF在肾细胞癌组织中表达水平明显高于正常肾组织，与肾细胞癌组织肿瘤大小、TNM分期、浸润性生长和转移具有显著相关。徐海波等[15]研究发现VEGF在膀胱癌组织表达水平明显高于正常癌旁组织，与膀胱癌病理分期、病理分级、癌细胞生长、迁移密切相关。王亚奇等[16]研究发现VEGF在人肾上腺肿瘤组织中表达水平高于正常肾上腺组织，可能与肾上腺肿瘤微血管形成及肿瘤细胞生长有关。本研究发现肾上腺恶性肿瘤组织VEGF mRNA相对表达水平显著高于良性肾上腺组织，临床病理特征分析VEGF与有无远处转移相关，提示VEGF可能参与肾上腺肿瘤的发生、发展，猜测VEGF可能通过调控血管生成从而影响肿瘤细胞的增殖、迁移等。Zhao等[17]在研究HOTAIR表达水平与胶质瘤侵袭性的关系中发现，HOTAIR表达水平与VEGF呈正相关。高建芝等[18]证实HOTAIR通过靶向VEGF/VEGFR信号通路，在肝癌细胞的侵袭和转移中发挥作用。本研究发现HOTAIR与VEGF具有正相关性，提示HOTAIR可能与VEGF共同发挥作用，调控肾上腺肿瘤发生及肿瘤患者不良预后。单因素分析显示HOTAIR低表达肾上腺肿瘤患者生存时间显著长于HOTAIR高表达肾上腺恶性肿瘤患者，VEGF mRNA低表达肾上腺恶性肿瘤患者生存时间显著长于VEGF mRNA高表达患者，多因素分析表明，远处转移、HOTAIR高表达、VEGF高表达是影响肾上腺恶性肿瘤患者不良预后的独立危险因素，提示HOTAIR高表达、VEGF高表达患者可能预示肾上腺恶性肿瘤患者易发生不良预后。

综上所述，本研究发现HOTAIR、VEGF与肾上腺恶性肿瘤的病情进展及预后具有相关性，HOTAIR、VEGF的表达水平与肾上腺恶性肿瘤患者有无远处转移具有密切关系，是否能成为肾上腺肿瘤治疗的靶位点，还需进一步深入研究HOTAIR、VEGF对肾上腺肿瘤的调控机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突