南极磷虾与鹰爪糙对虾酚氧化酶生化性质对比分析*

林瑞环 赵 玲 曹 荣,3 刘 淇

南极磷虾与鹰爪糙对虾酚氧化酶生化性质对比分析*

林瑞环1,2赵 玲2曹 荣2,3①刘 淇2

(1. 上海海洋大学食品学院 上海 200090；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071； 3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室 青岛 266071)

黑变是南极磷虾()贮运流通过程中的突出问题，为探究南极磷虾与普通海捕虾在黑变进程方面的异同，选取南极磷虾和海捕鹰爪糙对虾()作为研究对象，对2种虾在(2±1)℃贮藏过程中的黑变进程进行了感官评价，提取其酚氧化酶(PO)并进行了纯化，对2种虾PO的生化性质进行了对比分析。结果显示，冷藏条件下，24 h时南极磷虾的黑变已非常严重，黑变部位主要集中在头胸部、腹部甲壳以及尾节部分。72 h时鹰爪糙对虾的头胸部和尾节部分开始有轻微的黑变，之后逐渐扩散到躯干。南极磷虾和鹰爪糙对虾PO粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤后，酶的纯化倍数分别达到17.22和19.67。2种虾PO的最适温度分别为30℃和40℃，南极磷虾PO在低温下仍具有较高的活力。二者的最适pH均为6.0~7.0之间。焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、4-己基间苯二酚、L-半胱氨酸和抗坏血酸均可较好地抑制2种虾PO活力，其中，4-己基间苯二酚抑制效果最好。研究结果为南极磷虾冷链物流过程中的品质控制提供了依据，同时，为虾死后如何有效抑制其黑变提供了参考。

黑变；南极磷虾；鹰爪糙对虾；酚氧化酶

虾在我国渔业经济中占有重要地位，鲜销是其主要的产品形态，然而，鲜虾在流通和储藏过程中有一最为突出的问题––黑变。虾的黑变是其体内的酪氨酸或其衍生物等色原物质在酶的作用下经过一系列生化反应最终形成黑色素的过程，这一过程与酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)密切相关(Begoña, 2010)。PO可以催化虾体中的无色单酚化合物向双酚及双酚化合物转化，进而转化为醌类物质，醌类物质进一步与氨基酸或蛋白质结合生成黑色素，产生黑变，从而严重影响虾的外观，制约其商业价值(Friedman, 1996)。

PO是虾类黑色素生成反应的限速酶，研究其生化性质对于探究虾的黑变机理及防控方法具有重要的现实意义。目前，已有国内外学者对斑节对虾() (Rolle, 1991)、桃红对虾() (Simpson, 1998)、中国对虾() (汪小锋等, 2003)、日本对虾() (Soottawat, 2005)、长额拟对虾() (José-Pablo, 2009)和凡纳滨对虾() (鲍俊旺等, 2019)等的PO进行了分离纯化和生化性质研究，发现不同种类虾的PO在分子量、等电点、最适pH值、热稳定性以及动力学参数等方面均有很大差异。对于虾黑变的控制目前主要采用化学法，如亚硫酸盐类(李小蕾等，2012)、4-己基间苯二酚(周宇芳等, 2019)以及一些天然提取物(Jang, 2003; Nilesh, 2009; Nalan, 2008)等，均表现出了很好的防黑变效果，但对于酚酶活性的影响研究尚不够全面。

南极磷虾()富含8种人体必需氨基酸且比例适宜，具有很高的营养价值(聂玉晨等, 2016; 曹荣等, 2018b)，广泛分布于环南极大陆架水域，资源量极为丰富。在世界近海渔业资源普遍衰退的情况下，南极磷虾已成为世界渔业发达国家竞相开发利用的海洋新资源(曹荣等, 2018a)。在其运输过程中，大部分采用船上冷冻保藏到陆地上解冻二次加工的方法，在此过程中很容易发生自溶、黑变等变化，影响南极磷虾品质(陈怡炫等, 2018)。我国从2009年开始对南极磷虾进行大规模的商业化捕捞和加工(黄洪亮等, 2015)，但在船载加工技术和设备方面还比较落后，在南极磷虾贮运与利用方面的研究也比较薄弱(谌志新等, 2019)。鹰爪糙对虾()又称立虾、红虾，体型较小，体长与南极磷虾相似，是我国黄、渤海产量较高的一种海捕虾类，味道鲜美，是加工“金钩海米”的原材料(张树德等，1992)。目前，已有较多关于大宗虾类品种黑变方面的研究报道，但对南极磷虾黑变以及PO性质的相关研究较少，南极磷虾与普通海捕虾在黑变进程和机制方面是否存在差异也尚未可知。

本文选取南极磷虾及鲜活鹰爪糙对虾作为研究对象，观察2种虾在(2±1)℃贮藏过程中的黑变进程，从头胸部提取到PO粗酶并进行了纯化，对2种虾PO的生化性质进行了对比分析，旨在为南极磷虾冷链物流过程中的品质控制和死后黑变机理研究等提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验原料与试剂

南极磷虾由辽宁省大连海洋渔业集团南极磷虾作业船于2018年11月在南极海域捕捞，捕后包被冰衣，–30℃冻藏，2019年5月运抵实验室后，迅速用流动水解冻，选取完整的南极磷虾进行后续实验。

鲜活鹰爪糙对虾购于青岛市埠东水产品批发市场，充氧条件下30 min内运送至实验室，剔除死亡个体，选取体长均一个体(4~5 cm)，流水冲洗后加冰猝死，进行后续实验。

L-3,4-二羟基苯丙氨酸、硫酸铵、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、植酸钠、L-半胱氨酸、4-己基间苯二酚(4-HR)、抗坏血酸、苯甲酸、柠檬酸和乳酸等均为分析纯，购于美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑变进程观察 将解冻后的南极磷虾与猝死后的鹰爪糙对虾分别放置于(2±1)℃冰箱中，定期取样观察其黑变情况。

1.2.2 PO粗酶液的制备与部分纯化 参照汪小锋等(2003)的方法，略有改动。取虾的头胸部按1∶5 (/)比例加入预先冷却的磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L, pH 7.2)，剪碎、均质30 min后离心(4℃, 8000 r/min, 20 min)，取上清液，测定蛋白质含量及酶活力。

在上清液中缓慢加入固体硫酸铵粉末，并不断搅拌，分别收集0~40%、40%~75%和75%~100%部分的沉淀。将3组沉淀分散于磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.2)中，透析24 h，离心(4℃, 8000 r/min, 20 min)后取上清液，分别测定蛋白质含量及酶活力。

Sephadex G-100凝胶过滤柱(1.8 cm×75.0 cm)经磷酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.2)预平衡后，取40%~75%硫酸铵沉淀对应的组分上柱，以0.5 ml/min的流速进行洗脱，检测280 nm下的吸光度值，收集蛋白峰对应的组分，检测酶活力，收集酶活较高的管数，超滤浓缩后–80℃保存，留待后续实验测定。

1.2.3 PO比活力测定 参照Zamorano等(2009)的方法，略有改动。以L-3,4-二羟基苯丙氨酸为底物，将2.0 ml磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.2)与2.0 ml L-3,4-二羟基苯丙氨酸溶液(20.0 mmol/L)混合，30℃水浴中孵育，加入待测酶液0.2 ml混匀，反应5 min后，在波长为475 nm处测定吸光度值。每分钟吸光度值增加0.001定义为1个酶活力单位(U)。

采用双缩脲法测蛋白质含量，计算比活力(U/mg)。

1.2.4 温度对酚氧化酶活力的影响 将底物与待测酶液分别在5℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃条件下孵育后混合，反应5 min后测定酶活力。

1.2.5 pH对酚PO活力的影响 将底物与不同pH的缓冲溶液混合，使反应体系的最终pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，30℃水浴中孵育，加入待测酶液0.2 ml混匀，反应5 min后测定酶活力。

1.2.6 化学试剂对PO活力的影响 分别配制0.1%(/)的焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、植酸钠、L-半胱氨酸、4-己基间苯二酚、抗坏血酸、苯甲酸、柠檬酸和乳酸水溶液。将底物溶液与上述溶液1∶1(/)混合，30℃水浴中孵育，加入待测酶液0.2 ml混匀，反应5 min后，在波长为475 nm处测定吸光度值，计算酶活力。以磷酸盐缓冲溶液为对照，计算相对酶活力。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行处理，结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示，<0.01为极显著，<0.05为显著，>0.05为不显著。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾与鹰爪糙对虾冷藏过程黑变进程

由表1可以看出，南极磷虾的黑变进程与鹰爪糙对虾相比更为迅速。冷藏条件下24 h时，南极磷虾的黑变已经非常明显，黑变部位集中在头胸部、腹部甲壳以及尾节部分，这与长额拟对虾(José-Pablo, 2009)发生黑变的规律类似。鹰爪糙对虾在72 h时可以观察到头胸部、尾节部分有轻微的黑变，之后逐渐扩散到躯干。鹰爪糙对虾不同个体间的黑变进程略有差别，这可能与其死前的生理状态有关，虾个体在底物水平、酶激活因子等方面的差异也会影响黑变的进程。

2.2 南极磷虾与鹰爪糙对虾PO分离纯化结果

对2种虾PO的纯化结果见表2。南极磷虾PO粗酶液的比活力为1.58 U/mg，经硫酸铵沉淀后，得到初步纯化酶，其中，40%~75%硫酸铵沉淀组分的蛋白回收率为40.67%，酶活回收率高达67.11%，比活力提高至2.61 U/mg，该组分经Sephadex G-100凝胶过滤后，比活力达27.25 U/mg，纯化倍数提高至17.22。

鹰爪糙对虾PO粗酶液的比活力为1.28 U/mg，略低于南极磷虾，且PO活性主要集中在0~40%硫酸铵沉淀部分，酶活回收率达59.55%，这与赵娇等(1997)发现日本对虾PO活性主要存在于0~40%硫酸铵沉淀组分中一致。该组分经Sephadex G-100凝胶过滤后，比活力提高至25.21 U/mg，酶的纯化倍数达到19.67。

2.3 温度对PO活力的影响

温度对2种虾PO活力的影响如图1。南极磷虾PO在5℃和10℃条件下，活力极显著高于鹰爪糙对虾(<0.01)，这与其在低温储藏时黑变发生更为迅速的现象一致，最适温度在30℃左右，50℃以上活力迅速下降，这可能与南极磷虾生长的环境温度较低，南极海域海水温度范围在–1.3℃~3.0℃(李莹春等, 2012)有关。

鹰爪糙对虾PO在低温条件下活力较低，而50℃和60℃下的活力显著高于南极磷虾。鹰爪糙对虾PO的最适温度在40℃左右，这与凡纳滨对虾(鲍俊旺等, 2019; Nilesh, 2011)、中国对虾(樊廷俊等, 2002)等PO的最适温度接近。

图1 温度对南极磷虾与鹰爪糙对虾PO活力影响

*表示差异显著(<0.05)；**表示差异极显著(<0.01)

*: The difference is significant (<0.05);**: The difference is highly significant (<0.01)

2.4 pH对PO活力的影响

南极磷虾和鹰爪糙对虾PO随pH的变化规律较为一致，如图2所示，最适pH均在6.0~7.0范围内，酸性或碱性条件对酶活力都有一定的抑制作用，因此，南极磷虾在运输过程中提供一个酸性冷冻环境对其保鲜期延长效果会有帮助。

图2 pH对南极磷虾与鹰爪糙对虾PO活力影响

2.5 化学试剂对PO活力的影响

化学法是抑制虾类黑变最为常见的方法。几种化学试剂对2种虾PO活力的影响见图3。植酸钠、苯甲酸、柠檬酸和乳酸未表现出明显的PO抑制效果。焦亚硫酸钠和亚硫酸氢钠对南极磷虾和鹰爪糙对虾PO均有较好的抑制作用，相对酶活都低于60%。亚硫酸盐类在控制虾类黑变中应用广泛(李小蕾等, 2012; Ferrer, 1989)，其分解后释放的SO2可有效抑制PO活性，同时，可与黑变的中间产物–醌类化合物发生反应从而阻断黑变发生，但亚硫酸盐类在使用过程中往往存在过量使用、残留超标的问题，存在一定的安全隐患。

4-HR表现出很好的PO抑制效果，南极磷虾和鹰爪糙对虾PO经4-HR处理后，相对酶活力仅有30.16%和19.75%。4-HR可竞争性抑制PO，有效防止黑色素的形成(周宇芳等, 2019)。我国曾在20世纪90年代引进了美国瑞辉公司的“虾鲜宝”产品(殷邦忠等, 1994)，该产品的主要有效成份即4-HR，但4-HR成本相对较高，限制了其大范围应用推广。

L-半胱氨酸和抗坏血酸也表现出较好的PO活力抑制效果。抗坏血酸是一种强还原剂，可阻止底物被氧化成醌类以及醌类进一步聚合成黑色素，从而抑制黑变。L-半胱氨酸则直接与酶促反应的中间产物–醌类化合物结合生成无色的硫氢化合物(Soottawat, 2006)，从而阻断黑变的发生。这2种化合物均对人体无毒副作用，在食品安全方面更符合要求。

图3 化学试剂对南极磷虾与鹰爪糙对虾PO活力的影响

3 结论

冷藏条件下南极磷虾与鹰爪糙对虾黑变情况差异较大，南极磷虾黑变更为迅速，这可能与其生存环境有关，经过长期的自然选择，南极磷虾更能适应低温环境，所以其PO在低温条件下仍保持较高的活力。南极磷虾和鹰爪糙对虾PO的最适温度分别为30℃、40℃，最适pH均在6.0~7.0范围内，酸性环境能较好地抑制其酶活，因此，在2种虾的运输、保存过程中，可选择添加一些酸性物质来达到延长其保鲜期的目的。焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、4-HR、L-半胱氨酸和抗坏血酸均表现出较好的PO活力抑制效果，适宜用来配制虾类防黑变保鲜剂。

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Comparative Analysis of the Biochemical Properties of Phenoloxidase Isolated fromand

LIN Ruihuan1,2, ZHAO Ling2, CAO Rong2,3①, LIU Qi2

(1. College of Food Sciences and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200090; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Melanosis is a prominent problem in the transportation and storage of Antarctic krill. In order to explore the similarities and differences in the process of melanosis between Antarctic krill and common sea shrimps,andwere selected as research objects. A sensory evaluation of the melanosis process of the two shrimps during storage at (2±1)℃ were observed. The phenoloxidase (PO) was extracted and purified from the two species, the biochemical properties of which were further examined and compared. The results showed that the black spot formation was more serious in Antarctic krill under cold conditions at 24 h, and large areas of black spots were concentrated in the cephalothorax, abdominal shell, and tail of Antarctic krill. For, slight black spots were observed in the cephalothorax and tail after 72 h, and then gradually spread to the whole body. The crude PO solutions of the two shrimp species were purified using ammonium sulfate and filtered through Sephadex G-100 gel. The purification fold of the PO solutions ofandreached 17.22 and 19.67, respectively. The optimum PO temperature was 30℃ forand 40℃ forrespectively. The PO activity of Antarctic krill was higher at low temperatures and that of sea catch shrimp was higher at high temperatures. The optimum pH was between 6.0 and 7.0 for both species. Sodium metabisulfite, sodium bisulfite, 4-HR, L-cysteine, and ascorbic acid can all effectively inhibit the PO activity of the two shrimp species. Among these chemical reagents, 4-HR showed the best inhibitory effect on PO activity. The findings in this paper may provide a basis for the quality control during cold chain logistics of Antarctic krill, and also provide a reference for effectively suppressing melanosis in shrimps after death.

Melanosis;;; Phenoloxidase

CAO Rong, E-mail: caorong@ysfri.ac.cn

S983

A

2095-9869(2021)02-0124-08

10.19663/j.issn2095-9869.20200211002

http://www.yykxjz.cn/

林瑞环, 赵玲, 曹荣, 刘淇. 南极磷虾与鹰爪糙对虾酚氧化酶生化性质对比分析. 渔业科学进展, 2021, 42(2): 124–131

Lin RH, Zhao L, Cao R, Liu Q. Comparative analysis on the biochemical properties of phenoloxidase isolated fromand. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(2): 124–131

* 山东省重大科技创新工程专项(2018SDKJ0304-2)和中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费项目(20603022020013)共同资助 [This work was supported by the Key Science and Development Innovation Program of Shandong Province (2018SDKJ0304-2),and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022020013)]. 林瑞环，E-mail: 2055853201@qq.com

曹 荣，副研究员，E-mail: caorong@ysfri.ac.cn

2020-02-11,

2020-03-02

(编辑 陈 辉)