miRNAs小鼠哮喘模型中的作用初探

张冬姣，徐浩

哮喘个体免疫反应的改变可归因于遗传和表观遗传的改变[1-2]。MicroRNAs(miRNAs)是基因表达的转录后调节因子，在发育和炎症性疾病中受到不同的调节[3-4]。在过敏性气道疾病中，miRNAs的作用可以明显影响全身炎症反应和组织反应[5]。本研究利用动物模型来探讨miRNAs在哮喘发病机制中的作用，希望进一步了解miRNAs在哮喘中的特定作用。

1 材料方法

1.1 动物 选取6～8周龄，体质量18～20 g的BALB/c小鼠24只[SYXK(辽)2010-0002]，按随机数字表法分为正常对照组、卵清蛋白处理组、地塞米松治疗组各8只。

1.2 给药方法 (1)正常对照组：在饲养的第1、7、14天使用200 μL含1 mg的氢氧化铝的磷酸盐缓冲液(phosphate belanced solution，PBS)作为佐剂注射，第22～25天通过鼻腔吸入的方式给予小鼠鼻内吸入20 μL的PBS。(2)卵清蛋白处理组：在饲养的第1、7、14天使用20 μg乳化的卵清蛋白+200 μL含1 mg的氢氧化铝的PBS作为佐剂注射，第22～25天通过鼻腔吸入的方式给予小鼠鼻内吸入20 μL含有100 μg的卵清蛋白的PBS。(3)地塞米松治疗组：在饲养的第1、7、14天使用20 μg乳化的卵清蛋白+200 μL含1 mg的氢氧化铝的PBS作为佐剂注射，第22～25天通过鼻腔吸入的方式给予小鼠鼻内吸入20 μL含有100 μg的卵清蛋白的PBS，并且给小鼠腹腔注射2 mg/kg的地塞米松。

1.3 肺泡灌洗液的收集 实验完成后使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，随后颈椎脱臼法处死小鼠。剖开颈部并暴露气管，夹住远端气管，将滞留针插入气管中；使用1 mL注射器吸0.8 mL预冷的PBS，通过滞留针缓慢注射于肺中，并轻柔按摩肺部10 s后吸出；将两次收集的灌洗液离心，1 500 r/min，离心10 min，离心半径6 cm，将上清储存于-80 ℃冰箱待用。

1.4 炎症细胞的计数 使用血细胞分析仪分析支气管肺泡灌洗液中各种炎症细胞(嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)、嗜中性粒细胞(neutrophil，NEU)、巨噬细胞(macrophage，MAC)和淋巴细胞(lymphocyte，LYM))的数量。

1.5 酶联免疫吸附测定(ELISA) 使用ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-5和IL-13的表达水平。加一定稀释的待检样品100 μL于已包被的96孔孔板中，37 ℃孵育1 h。洗涤后加入酶标抗体100 μL。37 ℃孵育1 h，洗涤。加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物100 μL，37 ℃孵育30 min。终止反应，然后使用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度。

1.6 标本送检 每组取3只小鼠的肺组织1 cm剪碎，通过1 mL Trizol裂解，使用氯仿、异丙醇抽提获取总RNA。采用焦碳酸二乙酯水溶解后，送至沈阳汇佰生物科技有限公司进行miRNA基因芯片检测。

1.7 实时定量PCR TRIZOL法提取肺组织中的总RNA，反转录成cDNA，进行实时PCR。所用引物为miR-455，F(5′-3′)：TAA GAC GTC CAT GGG CAT，R(5′-3′)：GTG CAG GGT CCG AGG T；U6，F(5′-3′)：CTC GCT TCG GCA GCA CA，R(5′-3′)：ACG CTT CAC GAA TTT GC。

2 结果

2.1 哮喘对于炎症细胞的影响 卵清蛋白处理组小鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC和LYM高于正常对照组，地塞米松治疗组炎症细胞含量低于卵清蛋白处理组，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 炎症细胞的表达情况

2.2 哮喘对于细胞因子的影响 见表2。

表2 细胞因子的表达情况

表2结果表明，卵清蛋白处理组小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13的表达显著高于正常对照组，地塞米松治疗组细胞因子含量低于卵清蛋白处理组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 哮喘对于miRNAs表达情况的影响 卵清蛋白处理组的肺组织中miR-34和miR-155表达低于正常对照组，miR-21、miR-455和miR-126表达高于正常对照组0.497±0.174，且地塞米松治疗后这些miRNAs恢复到正常水平，见表3。

Real-time PCR结果发现，miR-455在卵清蛋白处理组为0.734±0.090，显著高于正常对照组0.497±0.174，地塞米松治疗后miR-455基本恢复到正常水平(0.426±0.256)，差异有统计学意义(F=4.9，P<0.05)。

表3 miRNAs差异性表达情况

2.4 miR-455与炎症因子的相关性 统计分析数据指出，miR-455与EOS、NEU、MAC和LYM的表达均呈正相关，结果见图1。

2.5 miR-455与细胞因子的相关性 统计分析数据指出，miR-455与IL-4、IL-6和IL-13的表达均呈正相关，结果见图2。

图1 miR-455与炎症因子的相关性分析

图2 miR-455与细胞因子的相关性分析

3 讨论

miRNAs在调节细胞活动中起着关键作用。据估计，它们可以调节超过60%的蛋白质编码基因。miRNAs通过与靶mRNA转录本上的互补同源序列部分结合来调节基因表达，从而抑制蛋白质翻译或mRNA降解[6]。miRNAs在血液循环中大量存在，一些miRNAs被认为是诊断、预后和监测癌症及其他疾病治疗结果的有效工具[6]。某些miRNAs被认为在哮喘发病机制中起作用[7]。研究指出在哮喘发病过程中，miRNAs通过调节Th2的存活、活化、增殖、分化和发育来控制过敏性免疫反应的强度[8]。一些miRNAs通过靶向衔接蛋白和转录因子参与了巨噬细胞激活和极化的调节。研究指出，哮喘模型血清中miRNA-29b-3p、miRNA-145-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-147b、miRNA-155、miRNA-193a、miRNA-500a、miRNA-502、miRNA-511下调，miRNA-147b、miRNA-181a/b上调，促进巨噬细胞M1的激活[9]。本研究旨在探讨小鼠哮喘模型中异常表达的miRNAs，希望探讨哮喘的发病机制，为哮喘的早期诊断和治疗提供新的可能。

本研究在构建了小鼠哮喘和治疗模型后，通过细胞分析和ELISA方法指出，卵清蛋白处理组肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC、LYM、IL-4、IL-6和IL-13的表达显著上调，地塞米松治疗后各种炎症细胞和细胞因子与卵清蛋白处理组比较表达下调明显。miRNAs芯片分析结果指出，多种miRNAs在卵清蛋白处理后出现异常表达的现象，其中miR-34和miR-155表达出现下调现象，miR-21、miR-455和miR-126存在表达上调现象。这些miRNAs中，miR-155已经被证明对于哮喘的发生具有调节作用[7-8]，本研究中筛选出差异性最为明显的miR-455目前在哮喘中的作用尚无明确报道。

miR-455已经在多种肿瘤中被证明发挥重要作用[10-12]，血清miR-455-3p被证明可以作为乳腺癌的生物标志物在乳腺癌的调节中发挥重要作用，通过靶向SOCO3促进非小细胞肺癌细胞的生长和侵袭，促进食管鳞状细胞癌的耐药性和侵袭性。在肺部疾病中转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)可诱导肺成纤维细胞产生miR-455，miR-455可以通过靶向刺激Ago2-IP的富集激活的成纤维细胞中的TGF-β1和Wnt途径，促进肺部疾病的进程[13]。本研究中发现miR-455的表达情况与小鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU、MAC、LYM、IL-4、IL-6和IL-13的表达呈正相关，推断miR-455可能通过调节炎症反应参与哮喘的进程。我们推断哮喘过程中TGF-β1可能通过促进miR-455的表达，促进炎症发展、加剧哮喘程度。

本研究表明，miR-455在卵清蛋白诱导的小鼠哮喘模型中显著上调，本研究为哮喘的治疗提供了新的可能。