循环肿瘤细胞在结直肠癌中的应用及研究进展

靳 博 综述，向 征 审校

(重庆医科大学附属第一医院胃肠外科，重庆 400016)

结直肠癌(CRC)在恶性肿瘤中发病率高达第四，病死率高居第二[1]。由于我国居民饮食向着低纤维、高蛋白脂肪结构转变，CRC发病率仍不断升高[2]。手术后肿瘤复发或远处转移，并因此继发各种严重并发症，是CRC患者死亡的主要原因。即使采用根治性手术并辅以化疗后，仍有近1/2的Ⅱ～Ⅲ期CRC患者会发生复发转移。因此，早期识别预后不良的患者，并予以更积极的治疗措施，对提升这部分CRC患者的生活质量及预后意义非凡。循环肿瘤细胞(CTC)是能够监测治疗效果并预测肿瘤患者预后的指标，是指因各种原因脱离原发实体肿瘤，进入血液并游离其中的肿瘤细胞。大部分肿瘤细胞进入外周循环后由于血液的剪切力、缺氧、机体的免疫识别、自身凋亡等因素会迅速死亡，仅少量存活。残存的CTC可聚集并黏附形成微小癌栓，随血流进入全身各处。在微环境适宜的靶器官中，CTC若逃避了免疫系统的识别，则可增殖形成转移灶。因此，肿瘤的血行转移与CTC紧密相连。因CTC来源于原发灶，与原发灶肿瘤细胞的抗原表达、基因突变情况、生物学行为高度相同，故可用于恶性肿瘤的“液体活检”[3]。因此，CTC在CRC的早期诊断、检测肿瘤复发转移、评估预后、指导治疗等方面具有重要意义，本文就CTC在CRC中的应用做一综述。

1 CTC的亚型

根据细胞分子生物特性，CTC可分为多个亚型。第一类是上皮性肿瘤细胞，和原发实体灶一样主要表达上皮性抗原的肿瘤细胞。第二类为经上皮-间质转化(EMT)的肿瘤细胞。不同于细胞化生，EMT的细胞丢失上皮特征性的基因表达、细胞形态、表面抗原后，转变为类似于间充质来源的细胞。此过程对于胚胎发育、修复受损组织十分重要。上皮来源肿瘤发生EMT时，会使肿瘤细胞原本高表达的上皮细胞特异性基因表达下调，而间质细胞特性的基因表达上调，使得上皮细胞特征性的E-钙黏蛋白水平大幅降低，而对应的间质细胞特征性蛋白显著升高，从而使其迁移、降解胞外基质等侵袭能力增强。同时，肿瘤细胞丢失极性，连接松散，也更容易穿越组织间质、基底膜向血管内渗成为CTC[4]。此过程在肿瘤形成早期既可发生，甚至可早于肉眼可见的肿瘤灶形成之前[5]。这种游离在外周血中、侵袭能力较强、具有间充质特性的肿瘤细胞就是EMT肿瘤细胞[6]。相较于上皮型CTC，EMT型CTC在预测CRC患者预后、评价疗效等方面更具优势，因其与CRC的疾病分期及血行转移关系更为密切，作为肿瘤生物标志物其价值更大，预测的各项结果更为精确[7]。但由于CTC研究的复杂性，现阶段许多检测方法主要针对上皮性CTC，对EMT型CTC的检测仍有待深入。最后一类为肿瘤干细胞(CSCs)，CSCs具有多向分化能力，在微环境适宜的靶器官中逃避免疫系统攻击后，可分化增殖产生异质性肿瘤细胞，产生转移灶。因此，原发灶的血行转移与能够自我更新的CSCs密不可分。KOJIMA等[8]观察了189例CRC术后标本的肿瘤细胞CD133表达水平，发现CD133阳性组患者比CD133阴性组患者总生存率(OS)更低，表明CD133阳性表达可独立提示CRC患者预后差，间接说明CSCs的存在与患者预后不良具有一定关联。

2 CTC的富集与检测

CRC患者CTC经肠系膜静脉汇入门静脉再进入肝脏，大部分会被肝窦中的库普弗细胞及其他免疫细胞杀灭，残存的肿瘤细胞再随心脏射血分散到全身外周血，因此，肠系膜静脉及门静脉血中的CTC水平高于外周静脉血。CTC相互聚集黏附，会降低单位血液中的肿瘤细胞密度，对检测造成一定影响，若3个及以上的CTC形成细胞肿瘤聚合体，则被称为CTC cluster。MOLNAR等[9]研究发现，CTC cluster与EMT肿瘤细胞密切相关，且其转移能力比单个CTC强。ACETO等[10]也发现，外周血中检出CTC cluster的患者比仅检出单个CTC的患者，肿瘤转移概率高25～30倍。CTC的水平很低，约100～1 000万个血细胞中仅有1个CTC。因此，要发现外周血中如此稀少的CTC，要先对其富集，再验证所获细胞是否为目标细胞。

2.1物理富集法 根据物理性质不同，将肿瘤细胞从血细胞中筛选出来的方法被称为物理富集法，如Oncoquick系统、ISET系统。通常CRC细胞体积和密度大于血细胞，通过物理特性而富集的CTC，因完整保留了细胞的表面抗原及结构，可继续行免疫组织化学、荧光染色，进一步研究基因表达情况。物理富集法简单易行且价格低廉，但缺点同样明显:特异性不高。在膜滤过分离法中，体积较小或细胞形态改变的肿瘤细胞可能通过滤过膜，某些直径较大的非肿瘤细胞(如大于8 μm的单核细胞)可能会被滤过膜截留；而密度梯度离心法可能出现肿瘤细胞及血细胞的迁移影响富集效果，特异性不高，可出现假阳性。

2.2免疫富集法 免疫富集法包括正向和负向富集两种，主要利用磁珠表面固定的特异性抗体与细胞表面对应抗原结合并形成复合物，从而将目标细胞固定在磁珠上，在磁场中与其他未被固定细胞分离,最终富集CTC。其中，正向富集的特异性抗体与CTC表面的特异性肿瘤抗原(如CK20、EpCAM等)结合，直接富集CTC。目前，唯一获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的Cell Search系统就属于免疫磁珠正向富集系统。它能捕获血液中EpCAM阳性细胞，再用CD45抗体和CK抗体区分白细胞和肿瘤细胞，所获CTC纯度较高。但是，EMT机制会导致肿瘤细胞的上皮性抗原减少，系统无法有效捕获EpCAM低表达的EMT肿瘤细胞，可能出现假阴性[11-12]。负向富集法过程类似正向富集，但其使用白细胞特异性抗体(如抗CD45)，其与白细胞表面抗原结合形成复合物后，可去除样本血液中的白细胞，反向富集目标CTC，因此不受EMT机制导致的肿瘤细胞上皮特征性抗原减少等因素影响，可用于所有上皮来源实体肿瘤且无视表面抗原的变化。其缺点是富集过程中少量的白细胞残留会明显影响细胞纯度。在实际工作中正、负向富集法常联合使用以提高检测效率。

2.3富集细胞验证 富集获得的细胞还需检测验证是否确为CTC，验证方法包含核酸检测法和细胞计数法。聚合酶链反应(PCR)属于核酸检测法，无法直接观察并计数CTC。使用PCR可检测外周血中的癌基因或抑癌基因DNA片段，简单易行，但因原发肿瘤细胞裂解时DNA片段释放入血，在血液循环可能已存在一段时间，因此检测到外周血中有肿瘤DNA片段，并不能直接证明血液中存在肿瘤细胞，故此法不适用于临床CTC检测。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)也是核酸检测法，可通过检测外周血中特定的逆转录DNA片段来证实CTC的存在。与PCR法不同的是，RT-PCR检测的对象为肿瘤细胞特定mRNA的逆转录DNA，通常癌胚抗原(CEA)、细胞角质蛋白19(CK19)等癌基因的mRNA在血液中并不存在，即使释放到血液中后也会很快被各种RNA酶降解，因此，只要RT-PCR在扩增后检测到外周血中CEA、CK19对应的特定逆转录DNA，即可间接证明CTC的存在，并可推断出CTC水平。此法也无法直接观察和计数CTC，可能受恶性肿瘤伴随炎症导致的肿瘤mRNA、上皮细胞污染血液样本、肿瘤基因异常表达等情况的影响。免疫细胞化学法(ICC)可直接观察和计数CTC。ICC技术将显色剂与针对肿瘤抗原的特异性抗体结合，其与肿瘤细胞表面抗原发生抗原抗体反应，实现肿瘤细胞的显色，所获细胞可进一步行荧光原位杂交(FISH)来研究CTC的基因表达、突变情况。缺点是目前所用特异性抗体(如CK)特异性不高，仍会受巨噬细胞、浆细胞表面抗原干扰，导致结果出现假阳性。流式细胞分析技术(FCM)与ICC类似，它使用被特殊荧光标记的特异性抗体，抗体与肿瘤细胞对应抗原结合时即可对肿瘤细胞进行标记和流式细胞检测，直接计数CTC。该法获得的细胞可在基因层面、蛋白水平、细胞形态等方面进一步开展研究。FCM技术也因抗体特异性不高，面临着检测结果特异性、敏感性较低的问题。在实际工作中，为提高检测效率，常常联合2种或多种方法进行CTC的检测。

3 CTC的应用及挑战

CTC已被用于转移性乳腺癌、前列腺癌、CRC的检测，但仍面临某些问题，如各检测方法各异不利于临床研究、检测时间节点无一致标准、cut-off值尚无统一标准等等，同时，仍需开发特异性更高的肿瘤抗原及相应抗体，以提高检测结果的可信度并兼顾EMT型CTC。能为临床提供更多信息的新型CTC检测手段也在不断出现，如单细胞测序随着基因组学技术进步而成为目前研究热点，可对CTC进行DNA扩增，实现对单个CTC的基因测序，以此研究CTC及原发灶肿瘤细胞基因表达、突变情况。当无法获取患者原发或转移灶肿瘤细胞时，可通过CTC进行肿瘤基因突变及耐药情况的动态监测。GAO等[13]通过单细胞测序对比了23例肿瘤患者的CTC、原发灶肿瘤细胞、转移灶肿瘤细胞的拷贝数变异(CNV)，发现CTC与转移灶细胞的CNV模式极为相似，同时部分CTC与原发灶CNV模式相同，提示这些原发灶具有转移潜能。

4 CTC在CRC中的应用

4.1早期诊断CRC Ⅰ～Ⅱ期CRC预后较好，但已有远处转移的患者，其5年生存率较早期患者迅速跌至10%～20%[14-15]。CRC早期症状不明显，许多患者确诊时分期较晚，肿瘤已穿透全层肠壁至周围组织器官或已有转移，故早发现、早治疗能有效改善CRC患者预后。CRC发病早期就可有肿瘤细胞进入外周血，发现CTC有助于肿瘤早期诊断[16]。粪便隐血试验快捷、廉价，但特异性低，常受到肠道炎症、痔等因素影响；CEA、糖类抗原199(CA199)等肿瘤标志物升高常提示肿瘤性疾病，但缺乏特异性，受某些良性疾病影响，且有许多CRC患者肿瘤标志物水平并不升高。肠镜检查可发现早期CRC甚至息肉等癌前病变等，检查前需进行机械性肠道准备，某些患者甚至不能耐受肠镜检查，肠镜检查也不能实时观察肿瘤的生长变化情况，不易常规实施。CT检查具有辐射，且只能发现肉眼可见的病变，结果存在一定的滞后性。相较以上检查项目，CTC检查只需抽取外周静脉血，具有方便、实时、微创的优点，在CRC早期诊断方面有独特优势。CTC也可同时筛查其他某些肿瘤性疾病。张波等[17]研究指出，当以0作为7.5 mL外周血中CTC数目的cut-off值时，CTC检出早期CRC的敏感度为63.3%(19/30)，且其水平与疾病分期、肿瘤分级呈正相关。WENSY等[18]研究显示，CTC检出Ⅰ～Ⅳ期CRC的敏感度为86.9%，特异度为97.3%，准确度远高于粪便隐血试验。

4.2检测肿瘤复发转移 通过研究有肝脏和骨微转移灶的CRC患者，MOHAJERI等[19]证实CTC可预测肿瘤复发转移风险。远处转移仍是消化道肿瘤患者死亡的主要原因[20]，在首次原发灶切除术后3年内，早期发现肿瘤复发转移能为某些患者争取再次治疗的机会。影像学及肠镜只能发现人眼可见的较大病灶，两者无法对更早期的微小转移瘤进行预警，而CTC数目的变化趋势可早期预测可能的肿瘤复发转移，甚至其预测结果准确度高于肿瘤标志物及正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)[21]，CTC也能比CRC相关肿瘤标志物更早、更灵敏地反映肿瘤复发转移[22]，具有为患者争取再次治疗机会的潜力。国内学者统计了1 847例CRC患者数据，发现有转移患者的CTC数目明显高于无转移患者，而有肝转移瘤患者的CTC检出数显著高于肝转阴性患者[23`]。TIEN等[24]的研究也指出,门静脉中CTC的数量可较准确地预测患者术后肝转移发生概率，证明CTC可预警影像学阴性的肝脏转移。姚月娟等[25]研究发现，在CRC患者中，复发转移患者检出CTC率比首次诊断患者约高40%，也证明CTC可用于检测有无肿瘤复发转移。

4.3评估预后 CTC作为一种潜在的微转移灶，其计数及其动态变化过程，尤其是在围手术期的变化趋势可用于预测肿瘤患者预后[26]，其与TNM分期联合应用可更精确预测患者预后[27-28]。荟萃分析发现，根据CTC数量基线将患者分为高数量组和低数量组，高数量组的OS和无进展生存期(PFS)均低于低数量组，预后明显更差(P<0.001)。对CTC动态随访结果进一步分析发现，由原本低数量组增加转变为高数量组的患者，预后差于从高数量组降低为低数量组的患者，相应的OS和PFS同样更短[29]。荟萃分析统计了2 363、3 129例CRC患者外周血CTC数据，发现无论TNM分期、采样时间、是否有过新辅助治疗、检测方法，CTC阳性均意味着更差的OS与PFS。CTC可独立预测CRC患者预后不良。同时，CTC检出数量与肿瘤局部分期、局部淋巴结转移、TNM分期、血管受侵情况紧密相关。这些证据均表明CTC比影像学检查可更好，能更早期地预测患者预后[30-31]。奚天益[32]的荟萃分析结果也证实，CTC数目与CRC的T分期、TNM分期等呈正相关。

4.4评估化疗效果 传统的RECIST标准以治疗后肿瘤大小变化来判断治疗效果，但某些情况下化疗后肿瘤的影像学体积无明显变化；而CTC在化疗前后计数变化趋势联合其他肿瘤标志物的变化，可补救RECIST标准中依赖影像学检查，导致某些情况无法准确评估疗效的欠缺。TAN等[33]研究转移性CRC化疗过程中CTC和肿瘤标志物变化情况，发现CTC更能反映疗效及病情进展状况。

4.5指导个体化治疗 现阶段肿瘤的治疗要求医务工作者根据患者病情、经济状况、化疗敏感度、不良反应等综合制定最佳的个体化治疗措施。靶向药物特异性强、不良反应少，但某些患者天然耐药，且初始敏感患者在靶向治疗过程中可能出现获得性耐药，因此监测靶向药物应用过程中患者的耐药情况，对更换治疗方案极为重要。BUIM等[34]研究报道，70%原发灶肿瘤细胞与CTC的Kras突变相同。MUSELLA等[35]研究亦发现，可通过对CTC基因检测，判断肿瘤对抗表皮生长因子受体靶向治疗是否敏感。YANG等[36]对正在靶向治疗的转移性CRC患者连续监测CTC的Kras突变情况，发现有30%的Kras初始野生型患者在靶向治疗中发生了突变。因此，在靶向药物应用过程中，可利用CTC随访肿瘤Kras突变情况，避免无效的靶向治疗。CTC还可帮助医师选择化疗药物。ABDALLAH等[37]研究显示，对CTC上胸苷酸合成酶进行测定，可了解肿瘤对5-FU的耐药情况以此判断患者在氟尿嘧啶(5-FU)应用中能否获益。对CTC基因、分子层面的动态监测，可帮助医务工作者合理利用靶向、化疗药物，及时制定敏感的治疗方案，并减少耐药药物相关的不良反应和患者不必要的经济负担。

5 总结与展望

CTC目前已用于预测CRC、乳腺癌、前列腺癌的预后[38-39]，其技术仍在快速进步，检测准确度也在不断提高，深入检测的单细胞组学结果也能为临床提供更多极具价值的信息。CTC检测不仅方便、微创，可用于CRC的早期诊断，其连续动态检测结果的变化趋势，对CRC疗效评估及预后判断有较大的实用价值，并可辅助制定个体精准治疗方案。当然，CTC也面临某些亟需解决的问题：现存的各种检测方式结果有较大差异[40]；需要采用统一的检测技术，找到最佳的cut-off值，开发更具特异性且兼顾EMT型CTC的肿瘤标志性抗原，提高检测结果的准确度。此外，进一步明确CTC与CRC转移、预后的关系，可使其发挥更重要的作用。CHEN等[41]发现，上皮细胞转化序列2基因在CRC患者和健康受试者之间差异表达比例较高(P<0.01)，可帮助提高CTC敏感度及特异度。当前CTC为临床工作提供的信息主要为分选计数和倍体，但高通量测序技术的迅速发展，将使单细胞组学成为CTC的重要发展方向。不同CTC亚群在CRC发生、发展、转移中发挥各自的作用，有必要充分利用单细胞组学对各亚群深入探究，明确其在CRC中的作用。其中，具有干细胞特性的循环肿瘤干细胞(CTSCs)可能是早期发现和阻止肿瘤发生、转移的重要环节，相较上皮型CTC，更加稀少、神秘的CTSCs可能值得更深入探究。