基于SSR分子标记的遗传学实验教学项目设计与探讨

李 楠，郭海滨，李亚娟，刘自强

（1.华南农业大学 公共基础课实验教学中心，广东 广州 510642；2.华南农业大学 农学院，广东 广州 510642）

遗传学是生命科学领域一门重要的基础、前沿学科，是生物学专业综合性较强的核心课程[1]。遗传学理论多是从实验中总结而来，实验在遗传学教学中具有十分重要的地位。当前，受高校教育专业化影响，遗传学综合性实验内容往往只对应理论中的某个知识点，当学生经过综合性实验学习，进入研究性实验时，很少能提出切实可行的实验方案，说明学生对知识的整合应用能力有待提升。2019年的“新农科”建设提出，以“融合发展”推动农林高校的内部改革及“两金一高”农林教育质量新标准，希望通过科教融合、产学研结合的人才培养模式，打破固有的学科边界、专业壁垒，推进“两性一度”金课建设[2]。在该思想指导下，我校遗传学教研团队深入开展科教融合人才培养模式探索，以科研成果为突破口，借助科研材料的表型优势，以及科研实验的前瞻性、综合性及连续性优势，进行了多学科、跨专业实验项目建设。本文所介绍的实验即为其中的一项跨专业综合性实验。该实验利用了明显的水稻叶色表型差异，融合了遗传学实验中的水稻杂交技术、遗传分析和基因连锁分析，以及植物生理学实验中的水稻育苗技术与叶绿体色素提取方法，并通过线上虚拟仿真实验与线下课堂实验、课内实验及课外开放实验紧密结合，打破了实验的时空束缚，对培养学生跨专业知识整合运用能力及创新研究能力具有重要作用。

1 实验材料的背景与设计思路

经甲基磺酸乙酯（ethal methane sulfonate，EMS）诱变缙恢 10号（J10）后，获得一个黄绿叶突变体ygl4(t)。因叶色与光合作用关系密切，叶色变异成为科学研究中的热点。研究表明，全生育期的黄化型叶色突变体多由隐性核基因控制[3-4]，变异会影响叶绿素的生物合成与降解，导致光合效率下降[5]。在对ygl4(t)的研究中发现，其突变性状受一对隐性核基因控制，该基因位于水稻第10染色体 RM1162与 RM7093之间[6]。

为使其更好地应用于实验教学，课题组进行了如下教学设计。以ygl4(t)和J10的叶片以及ygl4(t)和西农1A构建的F1及F2种子作为课程实验材料。首先，向学生介绍化学诱变剂（EMS）及其在科学研究中的重要应用价值，引出J10和ygl4(t)这对野生型与突变体材料，使学生通过观察两种材料的叶片叶色表型，直观了解野生型与突变体的概念及其差异。然后进行叶绿素含量测定实验，通过数据对比提出科学问题。其次，引导学生探讨如何针对该类型突变体，构建合适的遗传分析与基因连锁分析群体，并结合水稻田间杂交虚拟仿真实验，学习基因连锁分析的群体构建方法及水稻杂交技术。再次，向学生提供已构建好的遗传分析材料（包括亲本（ygl4(t)和西农 1A）及 F1和F2种子），结合课外开放实验，学习水稻育苗技术和遗传分析方法，探索表型差异下的基因型差异，进而理解基因型与表型的内在联系。最后，引导学生用所收集的F2群体中黄绿叶突变体叶片为实验材料，利用SSR分子标记，学习基因连锁分析方法，定位该突变基因，绘制遗传图。该实验整个教学设计基于问题引导式教学模式（problem based learning，PBL），以培养学生科学研究和整合应用能力为目的。

2 实验项目设计

2.1 实验目的

（1）了解 EMS诱变及其应用价值，学习质量性状基因的遗传分析方法、基因连锁分析群体构建方法及水稻杂交技术；

（2）学会配制植物营养液，掌握水稻育苗技术，了解水稻生长过程；

（3）掌握叶绿素含量测定方法和基因连锁分析方法，了解基因型与表型的关系；

（4）学会分析电泳结果，掌握统计处理方法。

2.2 涉及的主要理论知识与实验技术

该实验涉及的理论知识点与实验技术主要包括：经化学诱变所引起的基因突变、水稻生长发育过程及其育苗技术、植物叶绿体色素作用及其提取技术、水稻杂交技术、分离定律、微卫星标记、基因连锁分析及遗传作图等。

EMS诱变属于烷化剂诱变中的一种，能将 DNA分子中的碱基烷基化，进而因碱基替代形成点突变。当前EMS是化学诱变中效果最好的一种诱变剂[7]。

植物叶绿体色素包括叶绿素a、叶绿素b、β-胡萝卜素和叶黄素，是进行光合作用的重要物质。因其不溶于水，而溶于有机溶剂，因此可用乙醇或丙酮等进行提取，并采用分光光度计精确测定[8]。

SSR标记是一种以特异引物 PCR（聚合酶链式反应）为基础的分子标记技术。在真核基因组中存在串联重复序列，由10—50个重复单元（1—6个核苷酸）串联组成。由于其重复单元小，长度短，GC含量偏离基因组平均值，因此又将其称为微卫星序列[9]。

基因连锁分析是指利用分子标记与目标性状的连锁关系，在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内。主要技术包括基因组DNA提取、PCR和聚丙烯酰氨凝胶电泳[10]。

2.3 实验材料

实验材料ygl4(t)、J10和西农1A均由西南大学水稻研究所提供。以ygl4(t)和J10叶片及ygl4(t)和西农1A构建的F1和F2种子作为课程实验材料。

2.4 实验方法

2.4.1 叶绿素含量测定

参照Lichtenthaler等方法[11]，在水稻处于抽穗期时，将材料移入实验室中，让每组学生采集ygl4(t)与J10各 3株的剑叶、倒二叶和倒三叶，用研磨法提取水稻叶片叶绿素。即在研钵中加入少量石英砂和95%乙醇研磨至组织变白，然后将提取液转入25 mL容量瓶中定容，用分光光度计分别测定其在 470 nm、645 nm和663 nm处的吸光值。

2.4.2 基因连锁分析群体构建与水稻育苗培养

在课堂上，先和学生探讨如何构建适合ygl4(t)突变体遗传分析与基因连锁分析的群体；再提供给学生ygl4(t)、J10、西农 1A、F1种子和 F2种子，结合田间拍摄群体构建时的视频与图片资源，介绍本实验提供的群体构建策略，绘制构建过程图；然后学生用电脑访问“华南农业大学虚拟仿真实验教学项目管理平台”（http://222.201.224.39/virexp/）[12]，进入水稻幼穗分化实验项目中的水稻杂交虚拟仿真实验进行学习。

参考梁瑞等的方法[13]，挑选健康饱满的水稻种子，用5%次氯酸钠浸泡约15 min，再用蒸馏水清洗3次后，置于培养箱中 37 ℃恒温暗培养。出芽后，加入营养液，将白天温度调至35 ℃光照培养16 h，夜间28 ℃暗培养8 h，养至三叶期备用。

2.4.3 遗传分析与基因连锁分析

收集ygl4(t)、西农1A及F1各10株的叶片和200株 F2群体叶片，以叶片黄绿色和绿色为区分，进行F2群体叶色表型统计。统计完成后，将F2群体中黄绿叶突变体叶片独立包装于密封袋中，标记后置于超低温冰箱中备用。然后提供给学生2条不同染色体上的4对 SSR引物（见表 1），对两亲本与 F2突变群体进行基因连锁分析。基因连锁分析可参考刘自强等[14]的方法，包括水稻DNA提取、聚合酶链式反应PCR、聚丙烯酰氨凝胶电泳。在电泳带型统计中，将AA记为ygl4(t)纯合带型，BB记为西农 1A纯合带型，AB记为杂合带型。

表1 引物序列

2.5 实验结果与讨论

2.5.1 叶绿素含量测定结果

图1 野生型WT和突变体ygl4(t)的叶色表型

表2 突变体与野生型的叶绿素含量比较

从图1可以看出，野生型WT（J10）叶片为绿色，而突变体ygl4(t)叶片呈黄绿色。表2的叶绿素含量测定结果表明，ygl4(t)除叶绿素 a的含量与 J10相比无差异外，总叶绿素、叶绿素 b、叶绿素 a与叶绿素 b的比值（Chla/Chlb）均与J10有显著差异，其中叶绿素b及Chla/Chlb的差异达到极显著水平。ygl4(t)中Chla/Chlb的值达到25.94，约为WT的7.35倍。

2.5.2 基因连锁分析群体构建与水稻杂交

为了便于进行基因连锁分析，在与学生讨论后，通过引入遗传背景差异较大的西农 1A进行遗传分析群体构建，可以获得更多具有多态性的SSR分子标记用来进行 F2群体的连锁分析。F2群体构建的过程如图2所示。

图2YGL4(t)基因连锁分析群体构建过程

结合我校虚拟仿真实验教学项目管理平台，学生可进入水稻幼穗分化实验项目水稻杂交虚拟仿真实验中，通过虚拟操作已掌握的实验材料杂交时期判断、水稻去雄、套袋及授粉方法，结合田间水稻杂交实操视频资源，更加直观地学习水稻杂交过程（见图3）。

图3 水稻杂交虚拟仿真实验

2.5.3 遗传分析与基因连锁分析

对 F1及 F2群体叶色的调查发现，F1叶色正常，为绿色，而F2分离群体出现叶色分离，其中正常株有153株，黄绿叶有47株。卡方测验表明，正常株与突变株分离比例符合表明该ygl4(t)的突变性状受一对隐性核基因控制。

利用分布在水稻2条染色体上的4个SSR标记对F2群体中47株黄绿叶突变体进行连锁分析（见表3），发现第3号染色体上的两个标记RM3417和RM5513，与YGL4(t)座位之间的重组率均在 50%左右，表现为1∶2∶1的带型分离，表明这两个标记与YGL4(t)基因独立遗传，不存在连锁关系。而位于第10染色体上的两个标记，RM1162和RM7093与YGL4(t)座位之间的重组率分别为2.13%和4.26%，表明两个标记与YGL4(t)座位紧密连锁。利用Kosambi作图函数计算，YGL4(t)与 RM1162和 RM7093的遗传距离分别为 2.1 cM 与4.2 cM（见图4）（cM为遗传距离单位厘摩）。

表3 F2分离群体中黄绿叶突变体连锁分析

图4YGl4(t)的分子定位

2.5.4 实验教学延伸

实验结束后，教师要引导学生查询文献资料，了解水稻叶绿素突变体的专业分类。根据 Chla/Chlb的比值划分为 Chlb-less型与 Chlb-deficient型两类。Chlb-less型突变体的叶绿素 b含量极低，Chla/Chlb比值接近或超过20；Chlb-deficient型一般含一定量的叶绿素b，其Chla/Chlb比值在6～10之间[6]。然后根据专业分类标准推断该材料的类型，本实验结果表明，ygl4(t)突变体的叶绿素b含量极显著低于WT，且突变体Chla/Chlb的比值超过20，但叶绿素a含量与WT差异不显著，因此可以判断该材料属于典型的Chlb-less型突变体，其总叶绿素含量的降低主要是由于叶绿素b的下降所致。

在基因连锁分析课堂教学中，教师要指导学生学会利用Gramene网站（www.gramene.org）查询引物序列，并引导学生了解SSR的序列结构及其在基因连锁分析中的重要作用。在获得YGL4(t)基因的连锁分析结果后，教师还需进一步指导学生利用水稻基因组RAP-DB网站（https://rapdb.dna.affrc.go.jp）对位于RM7093与RM1162标记区域的物理距离和基因组序列进行分析。可以发现，2个标记之间的物理距离约为400 kb（kb为物理距离单位千碱基对），并存在3个与叶绿素相关的基因：CHL-CPN10、CAO1和CAO2。在此基础上，与学生进一步探讨YGL4(t)基因的精细定位、基因克隆技术、功能分析等方法，延伸学生遗传学知识的深度。

3 在实践教学中的应用与思考

3.1 实验安排

本实验需要学生以5—6人为一组协作完成，并结合线上虚拟仿真实验教学平台和线下课堂教学、课程内实验和课程外开放实验进行，整个实验总计5次课，每次课4学时。

1）第1次课。

介绍整个实验的目的与内容，重点讲解 EMS在科学研究中的应用，提供给学生ygl4(t)突变体和 J10野生型植株，先观察叶色差异，再开展叶绿素含量测定实验，通过数据对比引导学生提出科学问题。

2）第2次课。

在课堂上，先提问：如何构建适合ygl4(t)突变体的遗传分析与基因连锁分析群体？接着引导学生结合ygl4(t)和 J10的遗传背景差异思考：用这两个材料进行基因连锁分析材料构建是否合适？再提供给学生ygl4(t)、J10、西农 1A、F1种子和 F2种子，结合田间拍摄群体构建时的视频与图片，向学生介绍本实验提供的构建策略。引入遗传背景差异较大的西农1A进行遗传分析群体构建，并以此为基础绘制出构建流程图。然后结合虚拟仿真实验，引导学生学习水稻杂交技术。后2学时，讲解水稻育苗技术和遗传分析方法等，并结合课程外开放实验进行亲本（ygl4(t)和西农1A）及F1、F2水稻种子浸种，以及其他育苗实验（营养液配制、催芽、出苗）和遗传分析等。

3）第3—5次课。

基因连锁分析。该部分实验分两种情况，如果学生培养的F2群体生长很好，可以在三叶期时开展遗传分析，并收集黄绿叶突变表型进行基因连锁分析。如果学生因意外未获得预期水稻苗，可以就此问题分析原因，并提供给学生在超低温冰箱中提前备份好的水稻单株叶片用于遗传分析与基因连锁分析。本部分共安排3项实验内容，在每次实验之前，学生均需利用微课平台的线上MOOC、仪器教程及实操视频提前预习。①利用SDS法提取水稻叶片DNA。②利用4个SSR标记对 DNA模板进行聚合酶链式反应。要向学生讲解 SSR序列结构及重要用途，使其学会使用Gramene网站查询引物序列。③对PCR反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并记录带型和绘制连锁遗传图。要使学生学会利用RAP-DB网站查询标记区域的物理距离，了解基因组序列分析方法，并以叶色突变体为例，与学生探讨基因精细定位、基因克隆技术、功能分析等方法，拓展学生遗传学知识的深度和广度。

3.2 对实践教学问题的思考

教师既是科学研究的主体，也是实验教学的主体，教师将研究成果应用于教学，是推动实验教学改革的重要途径。科学研究中的实验材料丰富且有特色，实验技术先进，研究内容综合性、连续性强，以这些特殊研究材料为基础，可以很好地将多种实验内容及技术手段串联到一条线上。这种具有前后关联性和整体性的实验设计，对培养学生的跨专业知识综合应用能力及创新研究能力具有重要作用。例如，本实验以黄绿叶突变体材料为基础，还可进一步串联发芽率测定、水稻生长区域测定、光合效率测定、候选基因克隆及RT-PCR等实验内容。将一个完整的科学研究链条，通过截取、浓缩、拓展等方式，在一个实验项目中展示出来，能够帮助学生在已学过的多种知识间建立联系，进而锻炼学生的整合应用思维。

与此同时，本实验的应用尚有四个问题值得探讨。

（1）实验周期。虽然学生在整个实验过程中，能学到较多知识点，但对于当前的紧凑型学习方式来说，还是有明显的时间紧迫感。通过加强不同专业实验之间的联系，将重复性的实验整合到一个大的实验项目中，是解决实验时间紧张问题的有效途径。

（2）叶绿素含量测定需用新鲜叶片，因此在上课之前，教师需将田间抽穗期材料移栽至实验室内，这项工作对教师来说比较繁琐。由于该材料为全生育期黄绿叶突变体，可根据实验进度安排，在苗期进行叶绿素含量测定，这就大大提升了实验的灵活性。

（3）基因连锁分析涉及的实验步骤较多，且易受群体基数影响。为了培养学生的科学研究精神，应将该部分内容与课程外开放实验相结合，以满足学生重复实验的需求。

（4）在课堂教学中还需注重教学的层次性，即在综合性实验之外，需加强对研究性实验的引导。该实验并非止于基因连锁分析，后续还涉及基因精细定位、候选基因克隆及功能分析等实验内容。因此可引导学生利用类似的突变材料，结合开放实验平台，自行开展系统性的科学研究。学生通过“实验设计—田间栽培—实验室研究—数据整理与分析”的完整科研流程，可以实现自我科学研究能力和综合应用能力的提升。