河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析

王 硕,刘焱琨,夏艳辉,郝鹏辉,王 珂,李洪连,李 宇

(河南农业大学 植物保护学院，河南 郑州 450002)

烟草(Nicotianatabacum)是我国一种重要的经济作物，对国家财政税收具有十分突出的贡献[1]。河南省自然条件优越，是我国重要的烟叶生产区[2]。位于河南西南部的南阳，因其突出的区域优势，为烟草生长提供了优越的环境条件，是河南省重要的烟草种植区[3]。烟草在生长过程中会受到多种病原物的侵染危害，造成不同程度的经济损失，其中植物寄生线虫是烟草上重要的病原物之一。

短体属线虫(Pratylenchus)是一种迁移性的植物根内寄生线虫，寄主范围广泛，现已经报道了100多个有效种[4-7]。部分短体线虫可寄生在烟草根部，造成烟草根组织变褐腐烂，给烟草生产带来了重大损失[1,8-10]。刘学敏等[9]报道，短体线虫在吉林烟草种植区发生危害，但并未对采集到的线虫种群进行详细的鉴定，也未能确定发生在吉林省烟草上的短体线虫种类。刘修勇等[11]报道山东省烟草上有落选短体线虫(P.neglectus)寄生。焦永吉[12]发现河南省烟草种植区有桑尼短体线虫(P.thornei)的发生危害。李建立等[13]在湖北省烟草上发现有2种短体线虫，分别是咖啡短体线虫和刻痕短体线虫(P.crenatus)。陈代倩[1]检测到福建省烟草根部有穿刺短体线虫(P.penetrans)和咖啡短体线虫寄生。但上述研究大多集中在对烟草根际线虫的分离鉴定上，并未对其致病性进行进一步分析。2018年，笔者在河南省南阳市烟草种植区采集到变褐腐烂的烟株根系，并从中分离到大量短体线虫,本研究拟采用形态学和分子生物学相结合的方法对所采集的短体线虫进行准确鉴定，并利用室内盆栽试验测定其对烟草的致病力，旨在明确河南省南阳市烟草根际短体线虫的种类及其对烟草的致病性，进而为烟草线虫病害的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与线虫分离

在河南省南阳市方城县清河乡的烟草大田，采集了5个变褐腐烂的烟株根系样品。将采集到的病根剪碎后与根际土壤混匀，采用改良的贝曼漏斗法分离样品中的线虫[14]。

1.2 短体线虫的纯化培养

在体视显微镜下挑取短体线虫雌虫，并将单条雌虫消毒后接种在胡萝卜愈伤组织上，25 ℃黑暗培养大约70 d[15]，即可得到纯化后的短体线虫种群。

1.3 短体线虫的形态学鉴定

体视显微镜下挑取短体线虫，置于凹玻片上的无菌水中，在酒精灯火焰上加热杀死，快速将杀死的线虫挑至体积分数4% FG固定液(V(福尔马林)∶V(甘油)∶V(蒸馏水)=10∶1∶89)中进行固定，将固定好的线虫采用甘油-乙醇脱水法脱水，再采用蜡圈法[14]制作永久玻片。使用装有数码相机(Nikon DS-Ri2)和NIS-Elements AR专用软件的尼康光学显微镜(Nikon Eclipse Ti-S)对短体线虫玻片标本进行形态观察、特征值测量并拍照。

1.4 短体线虫的分子鉴定及系统进化树构建

参照王江玲等[16]的蛋白酶K法进行单条线虫DNA提取。rDNA-ITS区采用通用引物18S (5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26S(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)进行PCR扩增[17]；rDNA 28S D2～D3区采用通用引物D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)进行PCR扩增[18]。PCR反应体系参照KOD FX DNA聚合酶(Toyobo,日本)说明书配制。PCR反应条件为：94 ℃ 预变性2 min；98 ℃变性10 s，58.2 ℃ (ITS区)或51.7 ℃(28S D2～D3区)退火30 s，68 ℃ 延伸90 s，34个循环；72 ℃ 终延伸10 min。PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Omega,美国)纯化回收后，连接至pJET1.2/blunt克隆载体(Thermo Scientific,美国)，并转入DH5α感受态细胞，37 ℃ 培养12 h，挑取阳性克隆斑于含100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min振荡培养6～8 h，经菌液PCR验证后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将新获得的序列提交GenBank数据库，利用NCBI上的BLAST程序进行序列相似性分析。从GenBank数据库下载短体线虫rDNA-ITS和rDNA 28S D2～D3区序列，利用MEGA中的ClustalW方法进行序列比对分析[19]。采用MrModeltest 2.3进行最优核苷酸替代模型的选择。使用MrBayes重建短体线虫的系统发育树[20]。基于rDNA-ITS和rDNA 28S D2～D3 区序列分别构建进化树，参考已发表的文献[18,21]选择外组。

1.5 短体线虫的致病力测定

将健康饱满的烟草种子种植于装有灭菌土的花盆(直径24 cm)中，每盆3粒，覆土约1 cm，出苗7 d后剔除弱苗，每盆保留长势一致的单株健壮幼苗。将本研究获得的供试短体线虫种群接种在胡萝卜愈伤组织上，扩繁培养后制成1 000条/mL的短体线虫悬浮液。烟草种植30 d后，挑选长势一致的烟草植株接种短体线虫，每盆接种2 mL，接种量为2 000条/盆，共接种5盆，设置不接种线虫的烟草作为对照，接种线虫75 d后，观察短体线虫危害烟草的症状，测量烟草株高、地上部鲜质量和根鲜质量，分离统计烟草根际的线虫数量并计算线虫的繁殖率(Rf)：Rf=最终分离虫量/起始接种虫量。

1.6 数据处理

采用SPSS软件进行试验数据分析，对烟草株高、地上部鲜质量和根鲜质量分别采用独立样本t检验分析。

2 结果与分析

2.1 短体线虫的种类鉴定

2.1.1 形态特征 南阳烟草短体线虫的形态测量值见表1。

表1 南阳烟草短体线虫和咖啡短体线虫形态测量值的比较

由图1-A～I可见，南阳烟草短体线虫雌虫热杀死后虫体体直或略向腹面弯曲。头架骨化明显，唇区低平、略微缢缩，有2个唇环。侧区具4条侧线。口针短粗、强壮，基部球圆形至椭圆形。中食道球卵圆形，食道腺覆盖肠前端，覆盖长度约为体宽的1.2～3.3倍。排泄孔位于半月体后，半月体约2个体环宽。受精囊明显，圆形或椭圆形，内含精子。尾部近圆柱形，末端光滑窄圆。侧尾腺口小，位于尾中部。

由图1-J～L可知，南阳烟草短体钱虫雄虫虫体前端形态特征与雌虫相似。交合刺纤细，长15.4～19.9 μm，引带长3.8～5.5 μm，交合伞包至尾端，尾较尖。

从上述结果看，本研究中采集到的短体线虫种群的形态特征与文献[22]中咖啡短体线虫的形态特征较为一致，故将河南南阳烟草根际采集到的短体线虫种群初步鉴定为咖啡短体线虫。

雌虫(A～I)：A.雌虫整体,B.雌虫体前部,C～D.雌虫头部(箭头指示为口针),E.后阴子宫囊,F.受精囊,G.雌虫侧区侧线,H～I.雌虫尾部；雄虫(J～L)：J.交合伞,K.交合刺,L.雄虫整体

2.1.2 分子生物学鉴定 对河南南阳烟草短体线虫的rDNA-ITS区进行PCR扩增并测序，获得1条长度为1 249 bp的序列片段(图2)。在NCBI上进行BLAST分析，显示本研究获得的短体线虫rDNA-ITS区序列(GenBank登录号：MN749379)与GenBank数据库中咖啡短体线虫rDNA-ITS序列的相似性为93.97%～99.84%。

对河南南阳烟草短体线虫的rDNA 28S D2～D3区进行扩增并测序，获得1条长度为781 bp的序列片段(图2)。在NCBI上进行BLAST分析，显示本研究中获得的短体线虫rDNA 28S D2～D3区序列(GenBank登录号：MN750755),与GenBank数据库中咖啡短体线虫种群rDNA 28S D2～D3区序列的相似性为96.46%～100.00%。

M.DL2000 Marker;1.rDNA-ITS区扩增产物；2.rDNA 28S D2～D3区扩增产物

2.1.3 系统发育分析 基于河南南阳烟草短体线虫rDNA-ITS区和rDNA 28S D2～D3区序列，分别构建系统进化树。结果(图3和图4)显示，本研究获得的短体线虫序列与已报道的咖啡短体线虫序列形成高度支持的分支(PP=100)。该结果进一步证实，南阳烟草根际的短体线虫为咖啡短体线虫。

2.2 咖啡短体线虫的危害症状与致病性

观察发现，与对照组相比，接种咖啡短体线虫75 d后，接种组烟草植株表现为地上部生长缓慢，植株矮小、长势弱，叶片出现明显黄化症状。由于咖啡短体线虫的侵染危害，烟草植株的根系明显减少、质量减轻，出现坏死腐烂症状(图5-A～B)。在咖啡短体线虫侵染初期，烟草根系出现褐色或红褐色的侵染病斑(图5-C)；随着病情的不断加重，烟草根系的病斑不断扩大，出现整条根系坏死腐烂的现象，最终导致整个根系的大面积坏死腐烂(图5-D～E)。

超过50%的后验概率显示在相应的分支上，新获得的序列加粗显示。下图同

图4 基于rDNA 28S D2～D3序列的南阳烟草短体线虫的系统进化树

由表2可知，接种咖啡短体线虫75 d后，从烟草根部和根际土壤中分离得到大量的咖啡短体线虫，每株烟草根际平均虫量达到(11 613±581.09)条，繁殖率(Rf)达到5.81±0.29；接种咖啡短体线虫组烟草的平均株高为58.54 cm，平均地上部鲜质量和根鲜质量分别为49.50和20.58 g/盆，显著低于对照组(CK)烟草(其平均株高为75.73 cm，地上部、根的鲜质量分别为75.94和27.72 g/盆)(P<0.01)，表明咖啡短体线虫对烟草具有明显的致病性。

表2 接种咖啡短体线虫75 d后的虫量及其对烟草生长的影响

3 讨 论

植物寄生线虫是烟草的重要病原物之一，据报道，根结线虫(Meloidogyne)、短体线虫、球孢囊线虫(Globodera)、矮化线虫(Tylenchorhynchus)等都会侵染危害烟草，并造成一定的经济损失[1,10,23]。此外，长针线虫属(Longidorus)、拟长针线虫属(Paralongidorus)、毛刺线虫属(Trichodorus)、拟毛刺线虫属(Paratrichodorus)和剑线虫属(Xiphinema)的一些线虫种类不仅直接危害烟草植株，而且在取食过程中还会传播某些植物病毒造成更大危害[10,24]。短体线虫也叫根腐线虫，国内外均有其寄生危害烟草的报道。如在美国北卡罗来纳州和津巴布韦均有最短尾短体线虫(P.brachyurus)寄生危害烟草的报道[25-26]。在加拿大，穿刺短体线虫是危害烟草的主要线虫，给烟草生产带来严重的经济损失，除此之外还有落选短体线虫寄生危害烟草的报道[26-27]。另外，在美国田纳西州也有短体线虫(Pratylenchusspp.)寄生危害烟草的报道[28]。在国内，先后有落选短体线虫、桑尼短体线虫、咖啡短体线虫、刻痕短体线虫和穿刺短体线虫等寄生危害烟草的报道[1,9,11-13]。但是国内以往对烟草寄生短体线虫的研究，有些只是普查数据，或者仅进行了形态特征分析，大多缺乏详细的分子特征分析，也未见有关短体线虫对烟草致病性的相关研究报道。本研究采用形态学和分子生物学相结合的方法，对采自河南南阳烟草根际的短体线虫进行鉴定，明确此短体线虫种群为咖啡短体线虫。贺哲等[29]报道，从瑞昌山药上采集到的咖啡短体线虫的ITS序列与GenBank数据库中咖啡短体线虫相应ITS序列的相似度为93%～99%，变异达到7%。本研究获得的咖啡短体线虫ITS序列(MN749379)与数据库中咖啡短体线虫ITS序列的相似性为93.97%～99.84%，变异达到6.03%，在已有文献[29]报道的咖啡短体线虫种群ITS的变异范围以内。杜宇等[7]获得的咖啡短体线虫D2～D3区序列与GenBank数据库中咖啡短体线虫D2～D3区序列的相似度为97%～99%，变异达到3%。本研究中获得的咖啡短体线虫D2～D3区序列(MN750755)与GenBank数据库中咖啡短体线虫相应序列的相似性为96.46%～100.00%，变异达到3.54%，与文献[7]报道的咖啡短体线虫的种群内变异范围基本相当。短体线虫的这种种内差异比较常见，特别是ITS序列的种内变异较大，这可能与不同种群所处的地理环境不同有关[30-33]。本研究的室内盆栽致病性试验初步证实，该咖啡短体线虫种群可对烟草根系造成明显的危害，会导致根系腐烂而影响烟草的健康生长，明确该短体线虫种群对烟草具有较强的致病性，这为河南烟草线虫病害的诊断和防治提供了有效的理论依据。

河南是我国重要的烟草种植区，而烟草上另外一种重要病害，即烟草黑胫病在河南的发生也较为严重[34-35]。有研究指出，当最短尾短体线虫和烟草黑胫病菌共同存在时，短体线虫侵染造成的伤口能促进烟草黑胫病菌的侵染，从而加重烟草黑胫病的发病程度[10]。因此，河南省重要烟草种植区短体线虫的危害状况，及当地短体线虫种群的存在是否会加重烟草黑胫病的发生，均还有待进一步的调查和研究。

4 结 论

在河南南阳烟草种植区烟草植株根际发现了一种短体线虫,根据线虫的形态特征和rDNA-ITS、rDNA 28S D2～D3 区序列特征分析及构建的系统发育进化树，确定该短体线虫为咖啡短体线虫。经室内盆栽接种试验确定，该线虫能够侵染危害烟草根系，造成烟草根系腐烂坏死，烟叶黄化萎蔫，对烟草具有明显的致病性。