低氧条件下结直肠癌外泌体miR-449诱导M2型巨噬细胞极化的实验研究

杨 镛，蔡 枫,李小嘉,李 鹏,朱煜璋,李轶琨

上海中医药大学附属市中医医院：1.肛肠科；2.检验科，上海 200071；3.上海中医药大学，上海 201203

结直肠癌是全球范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一。据统计，2018年全球新增结直肠癌患者180万例，每年病死例数约88万，其发病率居肿瘤发病率的第3位，死亡率居肿瘤死亡率第2位[1]。近年来，我国结直肠癌发病率和死亡率呈逐年增长的趋势，其发病率和死亡率位均居我国恶性肿瘤前5位[2]。结直肠癌早期缺乏典型的症状与体征，约40%～50%的患者在确诊时已属于晚期，且已发生远处转移[3]。结直肠癌转移的主要部位是肝、腹膜和肺。目前，结直肠癌的治疗以根治性手术和放化疗为主。尽管最近在新疗法方面取得了进展，但这种恶性肿瘤的5年总生存率仍局限于50%左右。因此深入研究结直肠癌的发生机制、转移-侵袭机制及干预效应具有重要意义。

1 材料与方法

1.1实验细胞 结直肠癌细胞SW480细胞、正常状态单核细胞THP-1细胞来自上海中医药大学实验中心。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器 Himac CPBOW型超速离心机(日立公司)、生物安全柜(海尔公司)、酶标仪(Thermo公司)、MR Hei-End型磁力搅拌器(Heidolph公司)、垂直电泳仪(Tanon公司)、化学发光仪(上海勤翔科学仪器有限公司)、匀浆器(上海康华生化仪器)、CBOT簇生成仪(Illumina公司)、台式高速冷冻离心机(Thermo公司)、NanoDrop ONE型超微量紫外分光光度计(Thermo公司)、Qubit 3.0型荧光定量仪(Invitrogen公司)、电泳仪(中国天能公司)、凝胶成像系统(中国勤翔公司)、漩涡混合仪vortex-genie2(美林贝尔公司)、移液器(Eppendrof公司)、-80 ℃超低温冰箱(Thermo公司)、4 ℃/-20 ℃冰箱(海尔公司)、普通PCR仪(Life公司)、HiSeq X Ten型高通量测序仪(Illumina公司)。

1.2.2主要试剂 测序试剂TruSeq PE Cluster Kit-cBot、TruSeq SBS Kit(Illumina公司)，RIPA裂解液(强)、15-150 kDa型双色预染maker、Tris-SDS分离胶缓冲液(pH8.8)、Tris-SDS 浓缩胶缓冲液(pH6.8)、ECL化学发光液(Thermo公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF,生工公司)。

1.3方法 (1)电镜观察低氧和正常氧浓度(以下简称“常氧”)条件下SW480细胞外泌体的分泌:在常氧和低氧条件下分别接种相同浓度的SW480细胞,48 h后分离外泌体，电镜鉴定外泌体大小和表型；Western blot(WB)检测外泌体标志蛋白CD63、HSP70；比较低氧和常氧条件下SW480细胞外泌体的分泌水平。(2)采用佛波酯(PMA)诱导，将THP-1细胞诱导成人单核巨噬细胞，分别用PBS(作为阴性对照)、常氧条件下SW480细胞分泌的外泌体(SW480-N-Exo)、低氧条件下SW480分泌的外泌体(SW480-H-Exo)和白细胞介素(IL)-4(可诱导M2型极化，作为阳性对照)分别孵育诱导成功的巨噬细胞，PCR和WB分别检测M2巨噬细胞标志蛋白CD68和M1型巨噬细胞标志蛋白：转化生长因子-β(TGF-β)和IL-10。(3)对SW480-N-Exo和SW480-H-Exo中的小分子RNA(small RNA)进行测序，并进行生物信息学分析。(4)根据差异微小RNA(miRNA)的功能和通路，结合文献，从差异miRNA中，挑选表达量高、稳定且差异倍数大的3个miRNA作为候选miRNA。PCR验证测序获得的SW480-N-Exo和SW480-H-Exo中差异表达的miRNA;由于本课题组前期工作已发现miR-449与结直肠癌远端转移相关,因此挑选miR-449进行下一步工作：采用PCR检测结直肠癌患者和健康者血清外泌体中miR-449的水平，验证miR-449 inhibitor的干扰效率并检测外泌体miR-449 inhibitor对M2和M1型巨噬细胞标志蛋白水平的影响。

1.4统计学处理 采用GraphPad Prism软件进行作图和统计学处理，组间计量资料的比较采用t检验。生物信息学数据以软件统计图进行分析，包括GO功能富集分析图、KEGG通路富集分析图。

2 结 果

2.1低氧环境可促进SW480细胞的外泌体分泌 电镜显示所获颗粒大小为50～150 nm，见图1A；WB检测显示，所获颗粒特异性表达CD63，见图1B，说明获得的颗粒确实为外泌体。此外，低氧条件下SW480细胞分泌的外泌体水平高于常氧条件下的水平(P<0.05)，见图1C，提示低氧可以促进SW480细胞外泌体的分泌。

注：A为电镜观察低氧和常氧条件SW480细胞分泌的外泌体；B为WB检测SW480细胞及其分泌的外泌体中外泌体标志物在低氧和常氧条件下的表达水平；C为低氧和常氧条件下SW480细胞分泌外泌体相对水平的比较；与常氧组比较，*P<0.05。

2.2低氧诱导的SW480细胞外泌体促进M2型巨噬细胞极化 圆形的THP-1细胞被成功诱导成椭圆带尾巴的巨噬细胞，见图2A，并表达巨噬细胞标志蛋白CD68,见图2B。用SW480-N-Exo、SW480-H-Exo、PBS和IL-4分别孵育巨噬细胞，与SW480-N-Exo、PBS、IL-4孵育的细胞比较，SW480-H-Exo孵育的巨噬细胞中M2型巨噬细胞蛋白标记TGF-β和IL-10的表达增加(P<0.05)，M1型巨噬细胞蛋白标记IL-1β差异无统计学意义(P>0.05)，见图2C。这说明SW480-H-Exo促进M2型巨噬细胞极化。

注：A为THP-1细胞经PMA诱导，24 h后出现的巨噬细胞形态;B为PMA诱导后，PCR检测巨噬细胞标志蛋白CD68，与THP-1比较，**P<0.01；C为PCR检测M2型和M1型巨噬细胞蛋白标记，与PBS、SW480-N-Exo、IL-4孵育的细胞比较，*P<0.05；D为WB检测M2型和M1型巨噬细胞蛋白标记。

2.3低氧诱导SW480细胞的外泌体miR-449表达上调 通过测序发现，212个差异表达的small RNA，其中差异表达miRNA 90个，包括12个miRNA在SW480-H-Exo中上调，78个在SW480-H-Exo中下调，见图3A。对差异表达的miRNA进行靶基因预测并对靶基因进行GO分析，这些差异miRNA主要与转运功能相关，见图3B。

注：A为差异small RNA 的火山图；B为差异miRNA参与的前10个主要功能的GO富集分析。

2.4低氧可能诱导外泌体miR-449调控巨噬细胞表型 从差异miRNA中，挑选出3个miRNA作为候选miRNA。利用PCR进行验证，miR-449在SW480-H-Exo中上调(P<0.05)，见图4A。在10对结直肠癌患者和健康者血清外泌体中检测miR-449的表达，其在结直肠癌患者血清外泌体中的水平高于健康者(P<0.05)，见图4B。将miR-449 inhibitor转染低氧条件下培养的SW480细胞，提取外泌体孵育巨噬细胞发现，miR-449缺失后会抑制M2型巨噬细胞的蛋白标记的表达，见图4C、4D。说明低氧可能诱导外泌体miR-449调控巨噬细胞表型。

3 讨 论

在结直肠癌细胞生存的微环境中,缺氧和巨噬细胞等微环境因素对其代谢、侵袭、转移等功能影响重大[5],肿瘤细胞从最初的上皮间质转化(EMT),直至最终的定殖转移,缺氧一直是强大驱动力[6],而介导细胞对缺氧反应的主要机制是缺氧诱导因子(HIF)的稳定和激活，特别是HIF1a和HIF2a，它们激活一组促进肿瘤生长、血管生成和转移的基因[7]。在结直肠癌中，已有报道显示低氧条件下，可通过激活HIF，诱导结直肠癌细胞产生耐药性[8]、侵袭[9-10]和EMT[11]等属性。

外泌体是小的脂质双层膜泡，其大小(直径50～100 nm)、密度(1.13～1.19 g/mL)、形态学(透射电镜下杯形或碟形)和某些蛋白标记(CD63、TSG101、Hsp70)[12]为现今学术界研究热点。肿瘤细胞释放过多的外泌体，可能会影响肿瘤自身的起始、生长、进展、转移和耐药性[13]。例如，缺氧诱导的胶质瘤细胞可以通过将外泌体miR-29a和miR-92a转移至骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)，刺激功能性MDSCs的分化,影响肿瘤中免疫抑制微环境的形成[14]。低氧条件下培养的腹水卵巢癌细胞系的外泌体携带更多的致癌蛋白STAT3和FAS，能够显著增加肿瘤的进展/转移和化疗耐受性[15]。在低氧条件下，结直肠癌细胞通过外泌体介导的内皮细胞Wnt/β-catenin信号促进血管新生[16]。

低氧应激除了改变肿瘤细胞的代谢，同时也在改变巨噬细胞的表型和代谢，以诱导肿瘤促进的重新编程[17]。巨噬细胞是肿瘤基质中最丰富的细胞，具有明显的可塑性，在肿瘤微环境中通常被定义为两大类别:经典激活的M1型巨噬细胞和交替激活的M2型巨噬细胞。M1型是促炎性表型，具有抗肿瘤活性；M2型是免疫抑制细胞表型，参与肿瘤进展[18]。在恶性肿瘤中，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)主要与M2表型相似。研究发现，M2样TAMs通过驱动新生血管形成、介导细胞凋亡抵抗、抑制适应性免疫反应，确保肿瘤细胞存活、增殖、侵袭和转移，在细胞外基质重构中发挥重要作用[19]。此外，M2型极化巨噬细胞在肿瘤的缺氧区富集[20]。最新研究显示，低氧条件下，癌细胞通过分泌外泌体，促进巨噬细胞极化为M2表型。例如，低氧促使肿瘤细胞分泌富含miR-301a-3p的外泌体，通过激活PTEN/PI3K信号通路诱导巨噬细胞M2型极化，从而促进胰腺癌转移[21]。在低氧条件下，上皮性卵巢癌细胞来源的外泌体传递miRNA诱导M2型巨噬细胞极化，促进癌细胞增殖和迁移[16]。已有报道显示结肠癌细胞分泌的外泌体，通过miR-21促进肝巨噬细胞极化成M2型，促进肿瘤肝转移[22]。

有报道显示SPRY2只有在上调情况下促进结直肠癌EMT,而正常情况下它在多种癌症，包括结直肠癌中是作为抑癌基因[23]。SPRY2是p38-MAPK信号通路的内源性抑制因子[24]。最新报道显示，p38/MAPKAP Kinase 2(MK2)能促进肿瘤相关巨噬细胞极化成原癌性、促血管生成的M2样巨噬细胞[25]。本课题组前期已报道MAPK1介导miR-145促进结肠癌细胞增殖和迁移[26]。

综上所述，本课题组研究了低氧环境中结直肠癌外泌体miR-449与巨噬细胞之间的相互作用,发现低氧可以促进结直肠癌细胞外泌体的分泌；低氧诱导结直肠癌细胞的外泌体miR-449表达上调；低氧诱导结直肠癌细胞外泌体miR-449调控巨噬细胞表型，促使巨噬细胞M2型极化。初步验证了缺氧是调控结直肠癌转移的关键微环境因素这一中心观点,能为深入研究结直肠癌的侵袭性、转移机制提供基础性依据，为开发结直肠癌早期检测、预后判断和其他预测型生物标志物，降低临床实践领域中晚期结直肠癌的转移率、病死率提供有力的实验依据。