顶空气相色谱法测定甲氧普烯原料药中残留溶剂

宋 寒， 赵振芳， 朱盈蕊， 谢亚雄， 朱 雁， 任明浩

（1.河南省科学院高新技术研究中心，郑州 450003； 2.郑州市食品药品检验所，郑州 450000；3.华北水利水电大学地球科学与工程学院，郑州 450046）

甲氧普烯，又名烯虫酯，化学名为7，11-三甲基-2，4-十二碳二烯酸异丙酯，是一种昆虫生长调节剂类生物化学杀虫剂［1］，通过抑制未成龄的幼虫变态，干扰昆虫的脱皮过程，使成虫失去繁殖能力，从而有效地控制害虫种群增长［2-3］. 甲氧普烯与天然昆虫生长调节剂结构类似，且调节剂功能一致，可用于多种害虫防治，对非靶生物没有危害［4-5］. 甲氧普烯在土壤中会较快地分解成为二氧化碳和水，属于环保友好型杀虫剂. 目前甲氧普烯在美国、欧洲、日本、新西兰等经济发达国家被广泛地应用于农田治虫、食品防虫、蚊控、宠物保健等领域［6-7］. 2018年甲氧普烯成为在我国登记的第一个生物源农药［8］. 随着甲氧普烯的广泛使用其将在农业绿色管控中发挥重要作用，推进国家质量兴农发展［9-10］.

根据国家食品药品监督管理局《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》在原料药生产制备过程中使用的各类有机溶剂以及在生产过程中可能生成的新的有机溶剂，且没有任何疗效，且多数对人体和环境有一定的危害，为保障药物的质量和用药安全性，需对残留溶剂进行研究和控制［11］.

顶空气相色谱法将顶部空间萃取法和气相色谱联用的一种样品分析方法. 顶部气相色谱法是指将固体或液体样品放入密闭的样品容器中，在恒定的温度下加热震荡，使样品中的可挥发的气体成分从密闭容器底部的固体或液体样品中挥发至顶部空间，待挥发性气体混合物在顶部空间达到平衡状态时，从顶部空间定量移取气体部分并转移到气相色谱中进行分析. 因此只有挥发性物质达到气相色谱仪，而非挥发性的物质则留在样品容器中［12］. 在面对复杂基质的样品，尤其是较低挥发性基质中的挥发性物质的分析时，相对于液-液萃取、固相萃取等方法顶空萃取既可以避免样品处理过程中的挥发性目标物的损失同时又降低了非挥发共提取物的噪音干扰［13］，因此在分析此类样品时，顶空萃取法成为一种理想的方法. 随着顶空气相色谱法的自动化水平的提高，该方法已经被广泛应用于聚合物分析［14-15］、饮料和食品中挥发性成分［16-17］、血液中酒精［18-20］、水环境中挥发性有机物［21-23］以及香水和化妆品中香料等的分析［24］. 在制药行业中，顶空气相色谱法也广泛用于确定活性药物成分（API）和原料药中的残留溶剂［25］. 各国药典也陆续将顶空气相色谱法测定原料药中的残留溶剂收录其中［26-27］.

甲氧普烯原料药的生产过程中使用了多种有机溶剂，目前关于其溶剂残留测定的研究未见文献报道.本研究建立的顶空气相色谱法测定甲氧普烯原料药中丙酮、异丙醇、四氢呋喃、环己烷等四种残留溶剂的定量检测方法. 该方法简单、快速、不污染设备，能满足实际样品检测的需求.

1 实验

1.1 试药与试剂

甲氧普烯（洛阳某制药公司3批次），丙酮（色谱纯，上海试剂一厂），异丙醇（色谱纯，德国默克），四氢呋喃（色谱纯，上海试剂一厂），环己烷（色谱纯，上海试剂一厂），N，N-二甲基甲酰胺（顶空级，德国默克）.

1.2 仪器

Trace 1310（赛默飞世尔），TriplusRSH 顶空进样器（赛默飞世尔）.

PGH-300氢气发生器（北京谱莱析科技公司），PGA-L空气发生器（北京谱莱析科技公司）.

1.3 方法

1.3.1 限度确定 根据2015年版《中国兽药典》一部附录139页兽药中常见的残留溶剂及限度规定：丙酮、异丙醇的限度为0.5%，四氢呋喃的限度为0.072%，环己烷的限度为0.388%.

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取样品0.1 g，置于20 mL 顶空瓶中，精密加入1 mL N，N-二甲基甲酰胺，密封，振摇使溶解.

1.3.3 对照品溶液的配置 分别精密称取丙酮0.50 g，异丙醇0.50 g，四氢呋喃0.72 g、环己烷0.388 g，置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺定容作为储备液. 再分别精密量取0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容至刻度，分别作为L1、L2、L3、L4、L5 对照品溶液. 精密量取1 mL，置于20 mL顶空瓶中，顶空进样.

1.3.4 色谱条件 色谱柱：DB-624（30 m×0.53 mm×1.8 μm 6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷）；程序升温40 ℃保持5 min，以10 ℃/min 升温至160 ℃，维持1 min；检测器：氢火焰离子检测器（FID）；检测器温度：250 ℃；进样口温度：200 ℃；柱流速：1.5 mL/min；分流比：40∶1；顶空进样，孵化温度为90 ℃，孵化时间20 min；进样体积：1.0 mL.

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 进样方式选择 甲氧普烯具有较高的沸点，属于非挥发性化合物，采用液体进样的方式分析，甲氧普烯在进口不挥发会大量的留存在进样口导致进样口和色谱柱的污染. 而当采用顶空气相色谱法分析时，只有甲氧普烯中的挥发性的残留溶剂进入气相色谱分析，甲氧普烯因其低挥发性会保留在样品瓶中，从而避免污染仪器.

2.1.2 顶空条件优化 实验中考察50、60、70、80 ℃的孵化温度对检测灵敏度的影响，当孵化温度达到70 ℃后再升高温度，四种残留溶剂的响应值不再有明显的提升（见图1），因此选择70 ℃作为实验的孵化温度. 实验中考察10、15、20、30 min 的孵化时间对检测灵敏度的影响，当孵化时间达到20 min 后顶空瓶中气液两相分配达到动态平衡，再增加孵化时间四种残留溶剂响应增长不明显（见图2）. 为节省分析时间更高效的分析样品，选择20 min 作为实验的孵化时间.

图1 顶空孵化温度对残留溶剂检测灵敏度对影响Fig.1 Effect of equilibration temperature on detection sensitivity of residual solvent

2.1.3 色谱柱选择 在不同极性的色谱柱中筛查发现，由于丙酮和异丙醇沸点接近，在DB-5和RESTEK-WAX色谱柱中均不能实现基线分离；在DB-624色谱中丙酮、异丙醇、四氢呋喃、环己烷均能实现基线分离，且分析速度快、检测灵敏度高，非常适合这四种残留溶剂的定量分析要求，因此最终选择DB-624色谱柱.

2.2 方法验证

2.2.1 方法专属性 精密量取空白溶剂N，N-二甲基甲酰胺1 mL，置于20 mL顶空瓶中，顶空进样；另分别取供试品溶液和对照品溶液进样记录色谱图. 结果表明，空白溶剂不干扰目标化合物，目标化合物和相邻峰之间分离度均大于1.5（见表1），符合药典要求.

表1 四种残留溶剂的保留时间、塔板数及分离度Tab.1 Retention time，theoretical plants and resolution of the four residual solvents

2.2.2 方法重复性 精密称取同一批次样品0.1 g，置于20 mL顶空瓶中，加入L3对照品溶液1 mL，震荡使之溶解，顶空进样，记录色谱图，外标法定量，重复实验6次，计算结果. 丙酮、异丙醇、四氢呋喃、环己烷含量的RSD均小于3.0%，分别为1.04%、1.07%、1.18%、1.03%.

2.2.3 方法检测限和定量限 取对照品溶液逐级稀释，测定. 以信噪比约为3作为检测限，结果丙酮、异丙醇、四氢呋喃、环己烷的检测限分别为2.1、6.3、0.9、0.7 μg·mL-1；以信噪比约为10作为定量限，结果丙酮、异丙醇、四氢呋喃、环己烷的定量限分别为6.3、20.0、3.0、2.3 μg·mL-1.

2.2.4 方法线性关系 精密量取“1.3.3”中L1、L2、L3、L4、L5 对照品溶液，置于20 mL 顶空瓶中，顶空进样.以浓度为横坐标，响应为纵坐标做标准曲线，四种残留溶剂线性方程结果见表2.

表2 四种溶剂的线性方程、线性范围及相关系数Tab.2 Linear equations，linear ranges and correlation coefficients（r）of four solvents

2.2.5 方法回收率 精密称取已测定溶剂残留含量的样品9 份，分别精密加入L2、L3、L4 对照品溶液1 mL（各3份），按“1.3”进行测定，计算回收率，平均回收率在98.5%～101.3%，符合药典要求.

2.3 样品测定

取3批次供试品（20200501、20200502、20200503），按上述方法测定，四种有机溶剂残留量测定结果见表3.3个批次中均只检出环己烷，最高含量为10.5 μg·mL-1，低于限量值，符合药典要求.

表3 3批次原料药残留溶剂的测定结果Tab.3 Contents of residual solvents in three batchers of methoprene

3 结果与结论

近年来，国家对原料药生产过程中残留溶剂严格管控，生产厂家在研发新药的过程中在溶剂选择上，不仅要考虑其作为反应物、赋形剂及结晶溶剂等的作用效果，同时也要考虑最终脱溶剂后残留溶剂含量能否达到药典要求，本研究中的甲氧普烯在研发上由于吡啶、乙腈等溶剂残留量无法达到药典要求，曾多次更改生产工艺. 由此可见原料药生产过程中要注意溶剂的选择，关注最终产品溶剂残留量是否能够达到国家相关要求.

本研究首次对甲氧普烯中四种残留溶剂进行了定量检测分析. 通过进样方式选择、色谱柱分离条件优化、顶空条件优化等实验确定了准确、高效、能满足实际样品分析检测和质量控制的要求.