皮肤扁平苔藓组织miRNA-138及其靶蛋白表达

(青岛大学附属医院皮肤与性病科,山东 青岛 266003)

扁平苔藓(LP)是一种病因不明的慢性炎症性皮肤病，人群发病率低于1%[1]，主要累及皮肤和黏膜。其典型病理表现为基底细胞液化变性及真皮上部炎症细胞浸润带[2]。MicroRNA(miRNA)不易被血清中核糖核酸酶降解，在血液和组织中稳定存在[3-4]，在炎症、代谢和发育过程中发挥重要功能。miRNA-138(miR-138)是miRNA家族一员,有研究表明miR-138在口腔扁平苔藓(OLP)中表达降低[5]。细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p53是miR-138的靶基因。miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53是否在皮肤LP的发病机制中发挥作用尚不清楚。本研究旨在探讨miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53在皮肤LP病变组织中的表达及意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2018 年10月— 2020年3月，选取我院皮肤科收治的LP病人皮损组织标本40例(LP组)，病人临床表现典型并经组织病理学检查确诊为皮肤LP。选取同期我院美容外科手术切除的正常皮肤组织标本35例作为对照组。两组均排除其他系统性疾病，均未使用糖皮质激素治疗。

1.2 RT-PCR方法检测miR-138的表达

使用Trizol(日本Takara公司)从皮肤组织样本中分离出总RNA，第一链cDNA使用Mir-XTMmiRNAFirstStrandSynthesisandTBGreen试剂盒(Takara Bio USA, Inc)合成，实时PCR定量使用TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa)进行。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。miR-138引物(F：5′-AGCTGGTGTTGTGA-ATCAGGCCG-3′,R：5′-GTATCAACGCAGAGT-ACTTT-3′)、U6引物(F：5′-GGAACGATACAG-AGAAGATTAGC-3′,R：5′-TGGAACGCTTCAC-GAAATTGCG-3′)均由上海生工公司合成。

1.3 ELISA法检测Cyclin D1、P53蛋白表达

应用Cyclin D1 ELISA试剂盒(江莱生物公司)、人肿瘤蛋白P53 ELISA试剂盒(Elabscience Biotechnology 公司)检测标本Cyclin D1、P53蛋白含量，根据试剂盒说明书进行操作，同时设置空白对照孔。用酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度，绘制标准曲线，计算Cyclin D1、P53的表达水平。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 两组皮肤组织各指标检测结果比较

与对照组相比，LP组miR-138表达降低，差异有显著性(t=2.473,P<0.05)；CyclinD1、P53蛋白表达显著升高，差异有显著性(t=-2.257、-2.217，P<0.05)。见表1。

表1 两组皮肤组织各指标结果比较

2.2 miR-138与Cyclin D1、P53表达的相关性

Spearman秩相关分析显示，miR-138表达与Cyclin D1表达、P53表达均呈负相关(r=-0.248、-0.266，P<0.05)。见图1、2。

图1 LP皮肤组织miR-138表达与Cyclin D1表达相关分析

图2 LP皮肤组织miR-138表达与P53表达相关分析

3 讨 论

LP是一种慢性炎症性皮肤病，病程长，容易复发，常伴有瘙痒。其病因尚未明确，可能与遗传、免疫、感染、精神因素等相关。既往关于miRNA与LP相关性研究主要集中在OLP，针对皮肤LP的研究相对较少。本研究主要检测miR-138及其下游靶蛋白Cyclin D1、P53在皮肤LP中的表达，探讨其在LP发病中的意义。

由于miRNA不易被血清核糖核酸酶降解，在血液和组织中能够稳定存在，因此可用作临床诊断和疾病监测的生物标志物。WANG等[6]研究显示，miR-138表达水平升高可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，并且降低MMP-2和MMP-9的表达。ZHOU等[7]的研究结果显示，miR-138通过抑制MMP-2和MMP-9的表达降低了骨原性肉瘤细胞的侵袭。MMP-2、MMP-9是基质金属蛋白酶(MMPs)家族成员，MMPs能够降解细胞外基质的多种成分，在炎症反应、组织愈合、组织重构以及肿瘤的侵袭与转移等过程中发挥重要作用。研究显示，MMPs与LP的发病有关[8-10]。另有研究发现，miR-138下调导致Th1/Th2失衡，参与了银屑病的发病机制[12]。Th1/Th2平衡失调与LP发病密切相关[13]。本文研究结果显示，皮肤LP组织中miR-138表达下调，推测miR-138异常表达与LP发病相关。

细胞增殖、分化与凋亡间的动态平衡与细胞周期的正常运行密切相关。对LP病变中细胞的增殖状况以及细胞增殖与凋亡关系进行研究，将有助于揭示该病的发病机制。CyclinD1是LP病变中与细胞增殖有关的基因，p53是LP病变中主要与细胞凋亡有关的基因。本文研究结果显示，Cyclin D1、P53蛋白在皮肤LP中表达升高，推测Cyclin D1、P53可能通过破坏角质形成细胞增殖与凋亡之间的平衡关系，促进细胞增殖，诱导细胞凋亡，进而在LP发病机制中发挥重要作用。

GHALLAB等[5]研究结果显示，OLP病人标本中miR-138表达明显下调，CyclinD1基因和蛋白均过表达，二者表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验证实CyclinD1是miR-138的靶基因[14]。Cyclin D1是细胞增殖过程中意义最大的细胞周期蛋白，在细胞周期控制中发挥重要调节作用[15]。既往有研究显示，Cyclin D1可能参与OLP和LP的发病机制[16]。本文研究结果显示，LP病人皮损组织中miR-138表达减少，Cyclin D1表达上调，二者呈负相关，差异有统计学意义。推测miR-138低表达通过调控其靶蛋白Cyclin D1诱导细胞增殖，可能在LP的发病机制中起着关键作用。

P53是参与细胞增殖和凋亡的众多蛋白之一。双荧光素酶报告基因实验显示p53是miR-138的靶基因。有研究发现，P53在OLP和LP中表达升高[17-18]。既往对细胞凋亡异常的研究主要集中在OLP，而对LP与凋亡的相关性研究相对较少。在细胞的正常发育过程中，由于P53半衰期短，所以蛋白水平较低；细胞在应激状态下，其表达升高从而阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。本文研究结果显示，LP病人皮损组织中miR-138表达减少，P53表达上调，二者呈负相关，差异有统计学意义。推测miR-138表达下调会减弱对P53的抑制作用，从而诱导细胞凋亡，进一步证明miR-138的异常表达与LP发病相关。

综上所述，miR-138表达降低可能通过调控CyclinD1、p53基因表达，破坏角质形成细胞的增殖与凋亡之间的平衡关系，促进细胞增殖、诱导细胞凋亡，在LP的发病机制中发挥重要作用。