优质籼稻品种黄华占和扬稻6 号稻米理化特性和淀粉精细结构比较

陈飞 张昌泉 周少川 李爱宏 刘巧泉*

（1 扬州大学农学院/江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，江苏 扬州225009；2 广东农业科学院水稻研究所，广州510640；3 江苏里下河地区农业科学研究所，江苏 扬州225009；

*通讯作者：qqliu@yzu.edu.cn）

我国水稻单产已获得了较大进步，但稻米品质总体偏差，尤其是一些高产籼稻品种，稻米品质往往较差。胚乳是稻米的主要食用部分，其干质量的90%左右是淀粉[1-2]。一般认为，直链淀粉和支链淀粉构成了淀粉的半晶体结构，两者的组成和结构对稻米品质特别是蒸煮食味品质的优劣起到决定性的作用[3-4]。直链淀粉含量是影响稻米食味品质最重要的因素，也是最重要的评价指标。通常直链淀粉含量高的米饭质地偏硬，直链淀粉含量低的米饭比较松软。除直链淀粉含量外，直链淀粉的精细结构差异也显著影响米饭的口感[5]。此外，支链淀粉的链长分布差异是一些具有相似直链淀粉含量水稻品种间食味品质差异的重要原因[3,6]。

我国水稻种植区域广泛，亚种和品种间的品质差异较大。从籼稻品种的稻米品质上来看，籼稻品种的整精米率、垩白粒率、垩白度和直链淀粉含量的优质达标率往往都不是很高[7]。对长江上游的中籼稻、长江中下游和华南的晚籼稻胶稠度和直链淀粉含量的统计分析发现，近些年通过审定的品种胶稠度普遍有了提高，同时，稻米直链淀粉含量出现下降[7]。此外研究表明，近10 年来通过审定推广的籼稻品种稻米品质有了很大的提高，如黄华占、玉针香、中早35、丰华占、扬稻6 号等[8-9]。扬稻6 号是江苏里下河地区农科所选育的集优质、高产和多抗于一体的适应性强的中籼稻新品种[10-11]。黄华占是由广东省农科院水稻研究所选育的抗逆性强、生育期短、耐肥抗倒、米质特优的常规籼稻品种[12-14]。本研究以黄华占和扬稻6 号为试验材料，系统分析了这2 个品种的稻米理化品质和淀粉精细结构，以期探寻优质常规籼稻品质形成的理化特性和淀粉结构基础，为优质籼稻品质的进一步改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试品种与种植条件

黄华占（简写HHZ）和扬稻6 号（又名9311）于2019 年夏天正季种植于扬州大学农学院校区试验基地。5 月15 日播种，6 月12 日移栽，每个材料种植4行，每行10 株，株行距14 cm×18 cm。10 月5 日收割，按照常规栽培技术管理。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

将收获的成熟稻谷在自然条件下干燥1 周，用砻谷机出糙获得糙米，除杂后用精米机（日本Kett 公司）出精获得精米。部分精米用于淀粉的提取，其他精米利用旋风式磨粉机（丹麦FOSS 公司）磨成粉。米粉过100目筛后在40℃烘箱中烘2 d，随后在室温条件下放置2 d 用于平衡水分。最后用自封袋密封保存米粉，室温下存放待用。

1.2.2 稻米理化品质测定

表观直链淀粉含量（Apparent amylose content,AAC）和胶稠度（Gel consistency, GC）分别按照NY147-88 和GB 17891- 1999 标准进行测定。碱消值（Alkali spreading value, ASV）的测定依照NY147-88 标准和LITTLE 等[15]方案进行。参照ZHANG 等[16]的方法利用快速黏度分析仪（Rapid visco-analyzer, RVA）测定稻米淀粉黏滞性，利用差示扫描量热仪（Difference Scan Calculation, DSC200F3, 德国耐驰公司）测定淀粉热力学特性。

1.2.3 淀粉的提取

参照ZHANG 等[16]的方法利用碱性蛋白酶去除米粉中的蛋白获得淀粉。此外，利用氯仿和甲醇混合液（1∶1，v/v）在40℃条件下抽提淀粉2 次，去除淀粉中的脂类。淀粉用90%酒精洗2 次后用冷冻干燥机干燥，将干燥了的淀粉过200 目筛，从而获得纯化淀粉。

1.2.4 淀粉粒形态和粒径分析

取2～3 粒成熟的精米，用镊子掰断获得横断面，用刀片切割获得平整的另一断面并用导电胶固定在样品上。样品喷金处理后直接在扫描电子显微镜（S4800II，日立公司）进行断面观察。对于纯化的淀粉，直接用镊子挑取微量淀粉分散在导电胶上，喷金处理后直接进行扫描电镜观察。为比较淀粉粒径分布，拍取相同放大倍数下的淀粉粒，用Nano Measurer 1.2 软件测定淀粉粒直径，每个品种测量300 粒，最后绘制淀粉粒径分布图。

1.2.5 淀粉链长分布分析

参照ZHANG 等[16]的方法用异淀粉酶（E-ISAMY，Megazyme，爱尔兰）脱去淀粉分支，随后用高温凝胶排阻色谱仪（GPC, PL-GPC 220，美国）测定淀粉的相对分子量分布。此外，利用高效液相阴离子色谱仪（HPAEC, Thermo ICS-5000，美国）分析支链淀粉的链长分布。

1.2.6 淀粉的晶体结构分析

参照CAI 等[17]的方法，利用多晶X-射线衍射仪（D8-ADVANCE，德国）分析淀粉的相对结晶度；利用傅里叶红外光谱仪（Varian 7000 FTIR，美国）分析淀粉的短程有序结构；利用小角X-射线散射仪分析淀粉的晶体片层强度和厚度。

1.2.7 数据分析

本研究中各个实验的每个样品至少进行2 次重复，并利用统计分析软件SPSS 21.0 以及Excel 进行数据处理，样本间比较采用单因素T-测验。试验中的数据为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 稻米主要理化品质的比较

相对于扬稻6 号而言，黄华占千粒重（20.56 g）显著低于扬稻6 号（32.59 g）。从外观看，黄华占和扬稻6号稻米垩白粒率分别为11.2%和13.5%，差异不显著，两者均为低垩白粒率品种。黄华占成熟稻米的表观直链淀粉含量为16.22%，显著高于扬稻6 号（15.00%）；总淀粉含量（7.89 mmol/L）与扬稻6 号（7.83 mmol/L）无显著差异；但是，黄华占稻米中的粗蛋白含量（8.28%）要明显低于扬稻6 号（8.73%）。由表1 可知，2 个稻米样品的水分、总淀粉含量和胶稠度无显著差异。碱消值（ASV）测定结果显示，2 个品种稻米均属于中低糊化类型，但黄华占的碱消值要低于扬稻6 号，说明黄华占稻米糊化温度要高于扬稻6 号。图1A 是2 个品种米粉热糊化特性（DSC 吸热曲线）的比较分析，较扬稻6 号而言，黄华占的吸热峰提前，起始、峰值和最终糊化温度都略高（表1），完成糊化所用的温度跨度也缩短，也就是说通过热糊化过程所需要的时间变短；此外，黄华占米粉糊化需要较高的焓值，即需吸收更多的热量。

评价稻米食味品质的另一重要理化指标是由RVA 仪测定的稻米黏滞性。如图1B 所示，2 个稻米样品的RVA 曲线较为相近。但是从特征值来看，黄华占米粉的峰值黏度（3288.5±13.4 cP）和崩解值（1263.5±26.2 cP）显著高于扬稻6 号（3048.0±15.6 cP 和796.0±2.8 cP）。此外，黄华占米粉的热浆黏度（2025.0±12.7 cP）和消减值（183.0±28.3 cP） 显著低于扬稻6 号（2253.5±14.8 cP 和415.5±6.4 cP）。两者的冷胶黏度（CPV）和初始糊化温度（PaT）比较接近。研究表明，RVA 谱特征值中的崩解值和消减值与稻米的食味品质密切相关，一般崩解值大而消减值小的稻米食味品质较好[18]。结合RVA 谱的特征值分析可知，黄华占米粉表现出较小的消减值和回复值、以及较高的崩解值，推测出黄华占的稻米食味品质可能优于扬稻6 号。

表1 黄华占和扬稻6 号稻米的主要理化和热力学特性比较

图1 黄华占和扬稻6 号米粉的DSC 吸热曲线（A）和RVA 谱（B）

2.2 稻米淀粉粒结构的比较

如图2A 所示，2 个品种稻米外观均为透明的长粒形，相对于扬稻6 号而言，黄华占粒长较短、粒宽较窄，但长宽比相似，两者无显著差异（图2B-D）。为明确2个品种稻米内部淀粉粒结构是否有差异，利用扫描电镜分析了籽粒断面的结构，如图2E-F 所示，2 个品种籽粒断面中的淀粉粒排列均较为紧凑且规则，无显著差异。同时对从稻米中分离纯化的淀粉粒做了观察比较，2 个品种的淀粉粒均较为规则，也无显著差异（图2G-H）。进一步基于扫描电镜结果计算了了2 个样品的淀粉粒径分布，2 个样品淀粉粒径分布较为相似，平均直径均在4.5 μm 左右，其中黄华占淀粉粒径较扬稻6 号稍大，但未达显著水平（图2I）。上述结果说明这2个品种在淀粉粒结构上无显著差异。

图2 黄华占和扬稻6 号稻米外观和淀粉粒扫描电镜观察

2.3 稻米淀粉精细结构的比较

为明确淀粉精细结构对稻米品质的影响，首先利用高温凝胶渗排阻色谱仪（GPC）分析这2 个品种稻米淀粉的相对分子量分布。如图3A 所示，2 个样品淀粉均被分成了3 个峰，基于已有研究，可知其中峰1 和峰2 分别为支链淀粉的短链（AP1）和长链（AP2）[16]，其中，扬稻6 号淀粉的AP1 组分稍有提高，但并不显著。研究表明，AP1/AP2 反映的是支链淀粉的分支度，其比值越大说明淀粉的分支度越高[17]。通过计算2 个样品的分支度，发现黄华占淀粉的AP1/AP2 比值（2.89±0.03）显著小于扬稻6 号（3.09±0.02）。第3 个峰表示的是直链淀粉组分（AM），从中可以看出黄华占淀粉的直链淀粉组分显著多于扬稻6 号，尤其是直链淀粉的短链组分更为明显。

进一步明确支链淀粉链长分布特点，借助于高效液相阴离子色谱仪（HPAEC）获得支链淀粉的链长分布特点的信息。通过计算黄华占与扬稻6 号支链淀粉链长的差值，发现黄华占淀粉的支链短链DP[（6～14）和（16～23）]部分明显减少，而中长链DP（25～34）和长链DP（42-70）部分明显增加。研究表明，淀粉的中长链是形成淀粉晶体结构的主要组分，较长的支链所形成的双螺旋结构更加稳定而使得熔解淀粉晶体所需要的温度更高[9]。因此，该结果能够较好的解释黄华占稻米较高的糊化温度。

图3 黄华占和扬稻6 号稻米淀粉的相对分子量分布（A）和支链淀粉的链长分布（B）

图4 黄华占和扬稻6 号稻米淀粉的X 射线衍射（A）和傅里叶红外光谱（B）分析

2.4 稻米淀粉晶体结构比较

稻米淀粉粒主要是由其中支链淀粉分子所形成的双螺旋晶体结构和部分支链淀粉及直链淀粉形成的无定型结构的半晶复合体，因此淀粉的分子结构对淀粉的晶体类型和结晶度具有重要的影响[19]。首先利用X-射线衍射（XRD）技术分析了2 个淀粉样品的晶体衍射情况。如图4A 所示，2 个淀粉样品均在衍射角2θ 角为15°、17°、18°和23°时产生单衍射峰，其中17°和18°附近的衍射峰为相连的双峰，属于谷物淀粉典型的A 型衍射类型[20]。但是进一步比较分析淀粉的长程有序结构（相对结晶度）部分，发现黄华占淀粉的相对结晶度（23.41%±0.21%）显著高于扬稻6 号淀粉（21.58%±0.16%）。该结果与淀粉的精细结构差异具有很好的一致性。因为淀粉晶体主要是由支链淀粉的中长链所形成的双螺旋结构组成，从而推断出黄华占淀粉中相对较多的支链淀粉长链是其较高结晶度的主要原因。此外，这也解释了黄华占淀粉较高的热焓值，因为淀粉结晶度越高，其在糊化过程中所需的热量也就越多[19]。

傅里叶红外光谱技术可以精确的解析淀粉晶体结构的短程有序的结构。如图4B 所示，黄华占和扬稻6号淀粉的红外吸收曲线较为一致。通常红外光谱中1045/cm 和1022/cm 的红外吸收峰是淀粉结晶区和无定形区的结构特征，两者的比值（1045/1022）能够反映淀粉分子的短程有序程度[21]。通过特征值的计算发现，黄华占淀粉的短程有序度（0.96±0.06）较扬稻6 号淀粉（0.92±0.04）高，但差异不显著。

3 讨论

3.1 稻米理化品质与稻米食味品质的关系

黄华占和扬稻6 号已经审定并推广多年，由于其较好的适应性、抗逆性和优良稻米品质特性，目前在国内种植面积仍然较大。稻米品质涉及多方面，而稻米蒸煮食味品质是消费者所重点关心的性状，该性状又涉及多个评价指标[22]。其中，直链淀粉含量是稻米重要的品质指标，通常优质稻米直链淀粉含量处于中等偏低水平（5%～15%），近些年来选育的优良食味软米类品种直链淀粉含量普遍在10%左右[23-24]。本研究中选用了2 个中等直链淀粉含量类型的籼稻品种，但黄华占稻米的表观直链淀粉含量和实际直链淀粉含量（AM）均高于扬稻6 号。研究表明，稻米直链淀粉含量与胶稠度、食味品质呈现负相关性[3，19]，但是通过RVA 特征值的数据可以看出黄华占稻米的食味品质可能优于扬稻6 号。研究发现，稻米蛋白质含量与米饭质地呈现明显的负相关[25]，此外，直链淀粉短链和支链淀粉的链长分布都与米饭的质地密切相关[3]。因而这种差异可能与黄华占稻米具有相对较低的蛋白质含量和淀粉精细结构方面的差异有关。

3.2 淀粉精细结构差异是稻米理化特性变异的重要原因

Wx 基因是稻米食味品质的关键基因，而参试的2个品种均携带Wxb等位基因，因此通过对两者稻米理化品质和淀粉精细结构分析可以获得除主效基因外的一些信息。综合分析结果表明，黄华占稻米蛋白质含量较扬稻6 号低，但表观直链淀粉含量相对较高。此外，尽管利用碱消值法测得的糊化温度2 个品种间无显著差异，但通过热力学特性分析表明，黄华占稻米的糊化温度高于扬稻6 号。淀粉结构分析表明，2 个品种在淀粉粒结构层面无显著差异，但是黄华占稻米淀粉中含有相对较少的支链淀粉短链以及较多的支链淀粉长链和较多的直链淀粉短链。研究表明，较长的支链淀粉长链能够形成更加稳定且更长的双螺旋结构。因此，淀粉的长程有序结构明显较高，而短程有序结构差异不显著。此外，多数直链淀粉分子在淀粉粒组装过程中存在于非结晶区内（无定型区域），因而直链淀粉增加会降低淀粉的结晶度[19]。本研究表明，尽管黄华占稻米淀粉的直链淀粉含量较高，但其相对结晶度仍然较高，分析可能与其增加的幅度较小有关。黄华占和扬稻6 号都携带相同的Wxb等位基因，直链淀粉含量属中等偏低。上述结果表明，除直链淀粉含量外，品种间也会因支链淀粉精细结构方面的差异而造成稻米品质的细微区别。

3.3 微调直链淀粉含量和支链淀粉结构的遗传调控位点

稻米品质性状的遗传调控机制复杂，尽管Wx 基因是直链淀粉含量调控的主效基因，但近些年来已经鉴定了多个直链淀粉含量调控的微效QTL 或基因。如ZHANG 等[26]鉴定的qsAC3 位点能够稳定提高约1%的直链淀粉含量。此外，一些直接参与淀粉合成相关的基因也能影响稻米直链淀粉含量，如ALK 基因。携带控制高糊化温度的ALKc 等位基因其稻米直链淀粉含量会有一定程度的下降[27]。本实验中，黄华占稻米的糊化温度较高，而其直链淀粉含量仍然相对较高，因此推测这种差异与ALK 基因等位变异无关。进而可以推测可能存在一些其他未知位点在微调直链淀粉含量和支链淀粉结构。本研究表明蛋白质含量和淀粉精细结构等差异可能是稻米食味品质差异的主要原因。