不同柑橘砧木对锰过量胁迫的耐受性及生理响应

邱洁雅，袁 梦，朱攀攀，凌丽俐，曹 立，付行政，彭良志

（西南大学柑桔研究所/国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）

锰是植物生长发育所必需的微量元素之一，它参与植物体内多种生理生化过程，例如，在光合作用中，它不仅是维持叶绿体结构的必要成分，还直接参与光合放氧过程[1]。此外，锰还作为酶的活化剂参与植物体一系列酶促反应，如磷酸化作用、脱羧基作用、还原反应和水解反应等[2]。但过量的锰则会引起植物中毒，柑橘属于对锰毒害较为敏感的植物，当柑橘受到过量锰胁迫时，不仅严重影响产量，而且果实品质也明显变差[3]。因此，探究常用柑橘砧木对过量锰胁迫的生理响应并筛选出对过量锰胁迫耐受性较强的砧木品种，对柑橘生产有重要意义。植物锰元素主要来源于土壤中三类有效态锰，即水溶性锰、交换态锰和易还原态锰，前两者均以Mn2+的形式存在，后者则是高价锰氧化物中易被还原成植物有效Mn2+的部分[4]。影响土壤锰有效性的因素很多，其中，土壤pH是最重要的影响因素，土壤中锰的有效性随pH降低而升高[5]。因此，酸性土壤上易出现植物锰中毒现象，碱性土壤则易诱发植物缺锰。我国柑橘主要分布在南方红壤、黄壤区，柑橘园土壤呈酸性或强酸性的比例高，且有部分土壤严重酸化。例如，贵州东南柑橘园绝大部分呈微酸性或酸性[6]，福建84%柑橘园土壤pH ＜ 5.5[7]，广西66.07%柑橘园土壤pH ＜ 5.5[8]，浙江84.6%柑橘园土壤pH ≤ 6.5[9]。由于我国柑橘园酸性土壤比例高，导致土壤和柑橘树体锰过量普遍。前人研究显示，湖南和湖北有41.7%[10]、江西赣南有51.6%[11]、浙江有59.0%[9]的柑橘园土壤有效锰含量为高量或过量水平，湖南和湖北柑橘树体锰含量偏高的占41.3%[10]，赣南脐橙叶片锰高量和过量的占28.1%[12]，广西柑橘叶片锰含量超标的占22.2%[13]，南丰柑橘叶片锰过量高达78.7%[14]。由此可见，我国柑橘园土壤和树体锰过量问题相当普遍，在较大程度上影响了柑橘产量和质量的提高。

柑橘树体为地下部分的砧木品种和地上部分的接穗品种嫁接而成。砧木作为树体的地下部分，负责将土壤中的矿质元素吸收并运送至地上部，因此砧木吸收利用养分的能力直接影响树体的矿质营养状况[15]。研究不同柑橘砧木品种对锰过量胁迫的耐受性有助于缓解或克服锰过量对柑橘的不利影响。然而，目前国内外对柑橘砧木对锰过量胁迫耐受性的比较研究还未见报道。我国柑橘产区因嫁接品种、气候和土壤等差异，各产区的砧木选用也有所不同。习惯上，我国大部分产区的柑类、橘类和甜橙类主要采用枳、红橘或酸橘做砧木，柚类主要采用酸柚 (近年来多用沙田柚替代) 和枳做砧木。碱性土为主的四川盆地则主要采用红橘做砧木，浙江、福建的海涂盐碱柑橘园一般采用枸头橙做砧木。资阳香橙是近年来兴起的杂交新砧木品种，具有生长快、投产早、嫁接亲和性好、抗裂皮病和碎叶病，在酸性和碱性土壤上均可生长良好等优点，已在生产上得到快速推广应用[16-20]。本试验选用生产上常用的4种柑橘砧木枳、资阳香橙、红橘和沙田柚为材料，比较其对锰过量胁迫的耐受性和生理响应，以期为柑橘生产上砧木的选用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

供试的4种柑橘砧木为枳[Poncirus trifoliate(L.)Raf]、资阳香橙 (Citrus junos‘Ziyang Xiangcheng’，ZyXc)、红橘 (Citrus reticulataHort.ex Tanaka，Tanaka)和沙田柚 [Citrus grandis(L.) Osb. ‘Shatianyou’，StY]。选取籽粒饱满的种子进行催芽，在根长约3 cm时移栽至基质为珍珠岩∶石英砂为1∶1混合的育苗盆中，在25℃、光照12 h/黑暗12 h的培养室进行培养，每天喷施适量蒸馏水。待苗长出2～3片真叶后，改为每4天浇一次1/2改良霍格兰营养液[改良霍格兰营养液配方如下：Ca(NO3)2·4H2O 8 mmol/L、KNO33 mmol/L、NH4H2PO41 mmol/L、MgSO4·7H2O 2 mmol/L、NaFeEDTA 0.05 mmol/L、H3BO30.015 mmol/L、MnSO4·H2O 0.01 mmol/L、ZnSO4·7H2O 0.005 mmol/L、CuSO4·5H2O 0.0015 mmol/L、Na2MoO40.0005 mmol/L]。150天后，选择生长状况相对一致的4种砧木实生苗移植到基质为珍珠岩∶石英砂为1∶1 混合的长方体塑料箱中 (59 cm × 45.5 cm × 32 cm)，每个塑料箱同时定植4种砧木，每种砧木定植10株，每4天浇一次改良霍格兰营养液进行预培养。预培养60天后进行不同浓度锰处理，每个处理3次重复，每个重复含4种砧木各10株。处理时，将营养液中的MnSO4·7H2O配制为5个浓度梯度：0.01 (对照，正常浓度)、0.05、0.25、1.25、6.25 mmol/L，分别记为：Mn0.01 (CK)、Mn0.05、Mn0.25、Mn1.25、Mn6.25，每4天浇一次上述改良霍格兰营养液。锰处理67天后，最高胁迫浓度处理下植株的死亡率超过50%，结束培养。

1.2 毒害情况调查与生物量的测定

试验过程中，经常观察记录植株锰毒害发生发展情况，在结束处理后取出砧木苗，分为地上部分和地下部分，先后用自来水、无离子水、蒸馏水清洗干净，凉干表面水分，分别称鲜重，然后置于烘箱中105℃ 杀青30 min，75℃烘至恒重，冷却后称干重。

1.3 生理生化指标的测定

处理60天时，用Li-6400型便携式光合测定仪(美国Li-COR) 测定成熟叶片光合指标，同时取叶样，测定叶片的叶绿素含量、电导率、丙二醛含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶3种酶的活性。叶绿素含量采用文献[21]的方法测定；电导率测定参照刘星辉等[22]的方法略有改动，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛 (MDA) 含量，氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶 (SOD) 活性，愈创木酚法测定过氧化物酶 (POD) 活性，过氧化氢分解法测定过氧化氢酶 (CAT) 活性。

1.4 叶片和根系的矿质营养元素含量测定

试验处理结束后，分别采集叶片和根系进行矿质营养元素含量测定。元素含量按照L/YT1270-1999方法进行测定。磷含量测定采用钼锑抗比色法，使用TU-9101紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) 测定。K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu测定采用原子吸收法，使用AA-800原子吸收分光光度计 (Perkin Elmer公司) 测定。

1.5 数据处理与计算公式

采用 Microsoft Excel 2013 和 SPSS 18.0 软件进行数据的统计、显著性分析和作图。

参照石永红等[23]和周广生等[24]的评价方法，采用隶属函数对4种柑橘砧木的耐锰性进行综合评价。根据在胁迫60天后测定的相对电导率、叶绿素含量、光合作用指标等生理生化指标和公式 (1) 求得各指标的耐锰系数，应用SPSS 18.0对各项指标的耐锰系数进行相关性分析和主成分分析，将各项原始指标转换为新的相互独立的综合指标。

利用公式( 2 ) 计算4 种柑橘砧木在锰毒害胁迫条件下，通过综合评价指标所得的耐锰性综合评价值D 值。D 值越大则表明该柑橘砧木的耐锰性越强。

公式 (3) 计算各项综合指标的隶属函数值。Xj为第j个综合指标，Xmin为第j个综合指标中的最小值，Xmax为第j个综合指标中的最大值。

公式 (4) 是根据综合指标贡献率求各综合指标权重。Wj值表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度，Pj为各砧木苗第j个综合指标的贡献率。

2 结果与分析

2.1 Mn过量胁迫下不同柑橘砧木的毒害症状及生物量

当Mn浓度在0.25 mmol/L以上时，4种柑橘砧木均生长迟缓、矮小，叶片不同程度地失绿，叶缘发黄，严重时全叶黄化、叶片干枯，甚至全株枯死；根系量减少、短小，呈深褐色，严重时死亡(图1a和b)。Mn0.25处理下，枳出现Mn中毒症状最早最明显，其余3种砧木仅表现为叶片轻微失绿，其中，资阳香橙症状最轻；在Mn1.25处理第62天，枳有一半以上叶片全叶黄化，67天死苗达到一半，而此时其余砧木无明显黄化叶，仅失绿加重，部分叶缘变黄；在Mn6.25处理第34天时枳的一半叶片全叶黄化，61天死苗达到一半，其余砧木在第52～57天，有一半叶片全叶黄化，到试验结束未出现死苗。

图1 过量Mn胁迫下4种柑橘砧木苗地上部(a)和地下部 (b)的毒害症状Fig. 1 Toxic symptoms of shoots (a) and roots (b) of four citrus rootstock seedlings under excessive Mn stress

处理结束后生物量测定结果显示 (表1)，随着Mn处理浓度的升高，4种柑橘砧木的生长受到抑制，地上、地下部分的鲜重和干重均下降。在Mn0.05处理下，枳的地上部、地下部干重与对照相比无显著差异；当Mn浓度升至0.25 mmol/L时，多数砧木苗地上部、地下部鲜重和干重较对照显著下降；Mn浓度升至6.25 mmol/L时，全部砧木的鲜重和干重显著低于对照；过量Mn处理使砧木根冠比总体上升(红橘除外)，说明过量Mn对地上部生长的抑制作用大于地下部。

表1 Mn过量胁迫下4种柑橘砧木苗的生物量Table 1 Biomass of four citrus rootstock seedlings under excessive Mn stress

2.2 Mn过量胁迫对不同柑橘砧木光合和抗氧化指标的影响

图2表明，Mn处理导致4种砧木叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a + b和类胡萝卜素含量均不同程度减少，减少幅度与Mn浓度成正比。具体而言，除Mn0.05与Mn0.01 (CK) 处理的光合色素水平无显著差异外，4种砧木在其他Mn处理下的光合色素含量均显著降低，在Mn6.25处理下，枳的光合色素含量降低最多，其叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a +b和类胡萝卜素分别较CK下降了92.53%、87.84%、91.52%和83.77%，而资阳香橙和红橘的光合色素受到的影响相对较小，沙田柚居中。

图2 不同Mn浓度处理下4种柑橘砧木苗叶片光合色素含量Fig. 2 Contents of leaf photosynthesis pigments of four citrus rootstock seedlings under different Mn concentrations

光合指标测定结果表明，随着Mn浓度的增加，4种柑橘砧木叶片净光合速率和气孔导度逐渐下降，而胞间二氧化碳浓度逐渐上升 (表2)。4种砧木苗的中毒症状在Mn0.25处理时才出现不同，在Mn0.05处理时4种砧木叶片净光合速率显著下降，说明出现Mn毒害的起始浓度应在0.05 mmol/L或以下。在Mn6.25处理时，4种砧木的净光合速率下降到0.19～0.75 μmol/(m2·s)，远低于正常值 3.71～4.02 μmol/(m2·s)。4种砧木的光合指标表现出相似的变化趋势，总体而言，Mn过量胁迫对枳和沙田柚砧木光合参数影响最大，对红橘和资阳香橙影响较小。。

表2 不同Mn浓度处理下4种柑橘砧木苗叶片光合生理指标Table 2 Photosynthesis indexes of four citrus rootstock seedling leaves under different Mn concentrations

细胞膜受损程度及抗氧化酶活性研究结果显示，4种砧木叶片的相对电导率随Mn处理浓度的升高而增加，上升速度和幅度由大到小依次是红橘、枳、沙田柚、资阳香橙。与对照相比，电导率上升最多的是枳和红橘，上升4.73倍，沙田柚上升2.92倍，资阳香橙上升2.42倍。红橘、沙田柚和资阳香橙叶片MDA含量总体上随Mn处理浓度升高而升高，处理浓度达到Mn6.25时MDA含量出现跃升，而枳在Mn0.25胁迫时MDA含量即达最大值，然后随Mn浓度的进一步升高而下降，可能是因为Mn浓度达到0.25 mmol/L时，枳细胞有关MDA的生化反应变缓或被部分停止。4种砧木叶片SOD活性随着Mn浓度的升高呈上升趋势，在最高Mn浓度(6.25 mmol/L)下，枳SOD活性最强，然后依次是红橘、资阳香橙和沙田柚。POD活性整体变化趋势为先上升后下降，其中枳的变化幅度最大。CAT活性则随Mn浓度的升高而下降，与对照相比，Mn6.25处理的红橘降低最多，沙田柚降低最少 (表3)。

表3 不同Mn浓度处理下4种柑橘砧木苗叶片细胞膜受损程度及抗氧化酶活性Table 3 Membrane damage and antioxidant enzyme activities in leaves of four citrus rootstock seedlings under different Mn concentrations

2.3 Mn过量胁迫对不同柑橘砧木叶片和根系矿质营养元素含量的影响

图3结果显示，在对照条件下 (Mn0.01)，枳、资阳香橙、红橘、沙田柚叶片Mn含量分别为75.9、71.6、49.6、42.8 mg/kg，处在正常含量范围(25～100 mg/kg) 内。Mn 处理使砧木叶片 Mn 含量升高，但不同砧木叶片的升高幅度不同，在Mn0.01至Mn0.25处理之间，枳叶片Mn含量的升高幅度大于另外3种砧木；在Mn0.05处理时，枳、资阳香橙、红橘、沙田柚叶片Mn含量分别为179.4、104.4、148.8、156.5 mg/kg，在 Mn0.25处理时分别为444.0、250.8、343.9、415.5 mg/kg，表明枳在低浓度过量Mn胁迫时更容易吸收累积和转移Mn；但是，在高Mn浓度处理（Mn1.25和Mn6.25）时，枳叶片Mn含量则明显低于另外3种砧木，可能是在更高的Mn浓度胁迫下，枳根系受到的伤害更重，影响了Mn的吸收和转移。4种砧木根系Mn含量随Mn处理浓度的升高而增加，Mn0.05处理使4种砧木根系Mn含量比对照升高约5倍，与Mn处理浓度的增加幅度几乎相同；然而，Mn浓度达到0.25 mmol/L以后，4种砧木根系的Mn含量剧烈增加，其中红橘和资阳香橙的根系Mn含量增长幅度高于枳和沙田柚。在Mn6.25处理时，4种砧木的根系中Mn含量由低到高依次为 7487.5 (枳)、8675.4 (沙田柚)、11814.3 (红橘)、12159.5 (资阳香橙) mg/kg。从砧木Mn迁移率看，从Mn0.01处理到Mn0.05处理，4种砧木Mn迁移率均出现锐减；Mn浓度高于0.05 mmol/L后，4种砧木Mn迁移率总体随Mn浓度的增加而升高，但不同砧木的升高幅度和原因不尽相同，枳因为在Mn浓度达到0.25 mmol/L以后中毒明显，根系处于衰亡过程中，锰迁移率几乎不再上升；资阳香橙在Mn浓度达到0.05 mmol/L以后，迁移率就进入极缓慢上升过程，但此时根系正常，可能存在主动抑制Mn向叶片过量转移的机制。

图3 4种柑橘砧木叶片和根系Mn含量及迁移率随营养液中Mn浓度的变化Fig. 3 Changes of Mn content in leaves and roots and translocation rate of Mn from roots to leaves of four citrus rootstock seedlings with different concentrations of Mn in nutrient solution

随着Mn浓度的升高，叶片K、P含量下降，而根系K、P含量上升；本研究条件下，Mn浓度升至最高6.25 mmol/L时，叶片K、P含量降至最低，根系K、P含量升至最高。4种砧木叶片和根系Ca、Mg含量整体随Mn浓度升高呈下降趋势，但叶片Ca、Mg含量和根系Mg含量下降幅度很小。Mn处理后，随Mn浓度增加，叶片Fe、Zn含量整体下降，而根系Fe、Zn含量整体则呈上升趋势。总体而言，Mn处理对柑橘砧木苗的P、K、Ca、Mg、Fe和Zn元素含量产生明显影响。在Mn浓度为0.01 mmol/L (CK)～0.05 mmol/L 时，砧木苗的营养元素含量即发生变化，并且与CK相比，枳根系P含量变化幅度最大值在Mn 1.25 mmol/L时出现，其余营养元素平均含量的变化幅度最大值均在Mn6.25 mmol/L 时出现 (图 4)。

（图4）

图4 不同Mn浓度下4种柑橘砧木叶片和根系营养元素含量Fig. 4 Nutrient contents in leaves and roots of four citrus rootstock seedlings under different Mn concentrations

2.4 不同砧木对Mn毒害耐受性的综合评价

砧木各项生理生化指标随Mn处理浓度的增加变化的规律不尽相同，若以单一指标评价耐受性所得结果准确性差。因此采用主成分分析及隶属函数分析法对4种砧木苗的相对电导率、叶绿素含量、光合作用指标等的耐性系数进行综合评价。根据计算所得的4种砧木苗的锰过量耐受性综合评价值D(表4) 可以判断4种砧木苗对锰毒害的耐受性强弱顺序为资阳香橙 (0.96) ＞ 沙田柚 (0.81) ＞ 红橘 (0.58) ＞枳 (0.00)。

表4 不同柑橘砧木的综合指标值 (F)、隶属函数值 (U) 和综合评价值 (D)Table 4 The comprehensive index value (F), subordinate function value (U) and integrated assessment value (D) of four citrus rootstock seedlings under excessive Mn stress

3 讨论

Mn是生长素氧化酶的激活剂，植物体内Mn含量的增加会引起该酶的活性增强从而导致植物生长受到抑制[25]。本试验中，随着Mn处理浓度的升高，各砧木的地上部和地下部鲜、干重均有所下降，砧木生长受到抑制，且经过过量Mn处理的砧木根冠比总体上升 (红橘除外)，说明过量Mn对地上部生长的抑制效果更强。薛生国等[26]研究也发现锰毒害主要危害地上部分，植株中87%～95%的锰被分布在地上部。

光合作用是植物重要的生命活动，光合指标是植物众多生理代谢的综合反映，在植物生物逆境和非生物逆境中，光合作用会受到抑制，光合指标受到影响，如净光合速率降低、气孔开度降低、胞间CO2浓度升高等[27-29]。过高的锰含量则会抑制根系对Fe、Mg等元素的吸收和活性，从而引起氧化性胁迫导致氧化损伤，导致叶绿素的合成下降、叶绿体结构被破坏[4]。本研究显示，在过量Mn处理下，砧木叶片褪绿，这是由于高锰胁迫导致砧木叶片叶绿素合成受到抑制而含量下降。同时，柑橘砧木叶片的光合指标明显变化，叶片净光合速率的下降与Mn处理浓度的增加表现出良好的趋同性。因此，在土壤酸性强、有效锰含量高的柑橘园，可以采用净光合速率指标的测定衡量树体是否锰中毒，这远比叶片营养诊断快速和简单。另外，过量锰会与细胞膜质产生氧化反应，损伤细胞膜结构，使大量MDA累积[30-32]。过量锰处理下的砧木苗相对电导率和MDA含量都显著升高，说明此时植物细胞膜已经受到了严重的损害。本研究中，枳叶片MDA含量随Mn浓度的升高呈先上升后下降的趋势，其他3种砧木则呈现上升趋势，不同砧木中的变化趋势有差异，这可能与砧木中膜脂过氧化作用途径发生变化有关。为了减少因为过量锰产生的活性氧自由基带来的危害，植物体内抗氧化酶SOD、POD、CAT活性会增加，清除体内活性氧[4,33-34]。本研究中，虽然Mn处理下，4种砧木的这些生化指标也发生明显变化，但由于锰的金属离子特性和酶活性的复杂性，其变化的规律性不一致。试验中随着锰处理浓度的升高，SOD活性增加，POD活性先增加后减少，可能是由于此时起主要作用的抗氧化酶是SOD。又因为重金属在植物体内的生物学作用机制不同，植物体内的CAT对不同重金属所产生的的生态效应也不同[35]，并且Fe是CAT的组分，过量锰会降低植物体内Fe的含量[34]。CAT含量在砧木受到过量锰胁迫后呈下降趋势，王丹媚等[27]试验结果也说明锰对CAT活性具有明显低促高抑作用。

植物体内矿质元素平衡是其正常发育的必要条件，但重金属胁迫会改变植物体内矿质元素的吸收与分布[36]。Pittman[37]研究发现，因为相似的离子半径，Mn和Ca、Mg在根部的吸收有拮抗作用。本研究显示，Mn处理后的砧木叶片与根系中Mg和Ca含量较对照降低，说明锰过量胁迫抑制了根系对Mg和Ca的吸收，这与申须仁等[29]和曾琦等[34]研究结果一致。另外，本试验中Mn处理导致柑橘砧木根系P、K、Fe含量上升，叶片P、K、Fe含量下降，说明高浓度锰影响了P、K、Fe在植株体内的转运分配，其机制尚待进一步研究。

何勇强等[3]研究发现柑橘是一类对锰毒害较为敏感的植物，栽培于酸性土壤的柑橘，在叶片锰含量超过100 mg/kg时，即会表现出锰中毒症状[3]。本研究发现，枳、资阳香橙、红橘、沙田柚砧木在锰浓度 0.05 mmol/L 处理时叶片锰含量 104～179 mg/kg，虽然此时在表观上看不到叶片锰中毒症状，但叶片净光合速率已显著下降，叶片电导率、SOD活性、POD活性也显著上升，说明在生理代谢水平上已受到锰过量的影响；柑橘叶片锰含量诊断适宜值为25～100 mg/kg[38]，从前人的研究结果[10,12-14]看，我国柑橘叶片锰含量超标比例高，尽管有些锰超标果园可能在外观上还看不到明显中毒症状，但在生理上已经造成了伤害，影响柑橘产量质量的提高，应引起重视。从本研究结果看，过量锰胁迫对砧木产生的影响是多方面的，砧木可通过调节保护酶活性等来对抗胁迫伤害。不同砧木对锰过量胁迫的耐受性存在明显差异，造成这种差异的原因有两方面，一个是锰吸收转运差异，另一个是对锰敏感性差异。与资阳香橙、沙田柚和红橘相比，枳更容易吸收转移锰，在Mn处理浓度仅0.25 mmol/L时，枳叶片锰含量即达到444.0 mg/kg，而资阳香橙叶片仅250.8 mg/kg；然而，枳对锰过量胁迫又比其他砧木更敏感，枳叶片锰含量1815 mg/kg时导致叶片黄化和死苗，而其余3种砧木叶片锰含量达到2065～2751 mg/kg时才出现一半叶片黄化，叶片锰含量达到2725～3837 mg/kg时仍未出现死苗。因此，应该是不同砧木对锰转运和敏感性的差异，共同导致了其锰耐受性差异。在酸性土壤柑橘产区应更加注意土壤和树体锰元素的栽培管理，以避免柑橘果实品质受到影响，造成生产上的损失。资阳香橙具有耐碱性强、与多种类柑橘亲和性好、丰产性好、抗逆性强等特点[18-20]，因此，建议在高锰土壤的柑橘园选用资阳香橙作为砧木。

4 结论

4种柑橘砧木在锰浓度0.05 mmol/L时即会出现生理指标变化，锰浓度0.25 mmol/L时叶片和根系出现表观锰中毒症状，枳对锰过量胁迫最为敏感；综合评价4种砧木耐锰过量胁迫的强弱顺序为：资阳香橙 ＞ 沙田柚 ＞ 红橘 ＞ 枳。