禽致病性大肠杆菌luxS和rbsC双基因缺失株的构建及其生物特性分析

涂春田，左佳坤，蒋 蔚，陈兆国，米荣升，黄 燕，韩先干，汪 洋

（1.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenicEscherichia coli，APEC）引起的禽类不同疾病的总称，APEC能引起鸡、鸭和其他禽类局部或全身感染，造成家禽较高的发病率和死亡率[1]，开展对APEC致病机理的研究，对禽大肠杆菌病的防控具有重要意义。

由LuxS/AI-2介导的群体感应系统（Quorum sensing，QS）广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，其信号分子AI-2被认为是种间通用信号分子。AI-2的合成需要luxS基因编码的LuxS蛋白酶的催化作用，细菌产生的AI-2分泌到细胞外环境，通过一系列的调控机制参与QS相关的基因的表达，如生物被膜的形成和毒力因子等基因的表达[2]。本实验室在前期已发现luxS基因与APEC的致病性密切相关[3]，且研究发现在luxS基因缺失株的基础上缺失aroA基因能够进一步降低APEC的毒力，具有成为该菌减毒疫苗候选株的潜力[4]。

APEC中的核糖转运由周质核糖结合蛋白（RbsB）、疏水膜蛋白（RbsC）和亲水性ATP结合蛋白（RbsA）组成的系统调控。RbsC蛋白是疏水膜蛋白，拥有6个跨膜结构域作为核糖通过膜的通道[5-6]。RbsC在大肠杆菌中除了具有转运核糖功能外，是否与APEC致病性相关，是否能作为减毒疫苗的靶点，目前尚未见相关报道。

本研究利用Red重组技术在DE17ΔluxS的基础上，进一步构建了双基因缺失株DE17ΔluxSΔrbsC，并比较它们的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力、致病性等生物学特性差异，为评价该双基因缺失株作为减毒疫苗及其减毒机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂 APEC DE17ΔluxS缺失株由本实验室构建和保存[3,7]。2×TaqPCR Master Mix购自北京康为世纪有限公司；2×primer STAR Max DNA Polymerase、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶（BamH I、KpnI）、DL500 DNA marker、DL200 DNA marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；氯霉素购自Promega公司；氯化钠购自BD公司；酵母浸出物和蛋白胨购自OXOID公司。

1.2 主要仪器设备 低温离心机购自美国Thermo Fisher公司；自动高压灭菌锅购自日本TOMY公司（型号X-500）；恒温培养箱购自上海新苗公司（型号GNP-9270BS-Ⅲ）；恒温振荡培养箱购自北京创新思成公司（型号TS-2102）；超净台购自浙江苏净净化公司；PCR仪、分光光度计购自德国Eppendorf公司；电转化仪、核酸电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 引物设计 根据GenBank（EU549863.1）公布的rbsC及其上、下游序列，分别设计用于扩增rbsC的2对引物rbsC-UF/rbsC-UR和rbsC-DF/rbsC-DR；用于扩增抗性基因的引物为Cm-rbsC-F/Cm-rbsC-R；用于鉴定rbsC基因缺失株的2对引物为rbsC-inF/rbsC-inR和rbsC-outF/rbsC-outR（表1）。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 DE17ΔluxSΔrbsC双基因缺失株的构建 以DE17ΔluxS缺失株为亲本株，使用改良的Red重组方法[7-8]构建rbsC突变菌株：以DE17ΔluxS基因组为模板，分别使用引物rbsC-UF/rbsC-UR和rbsC-DF/rbsCDR，通过PCR扩增rbsC基因的上游和下游片段。以pKD3为模板，用引物Cm-rbsC-F/Cm-rbsC-R通过PCR扩增氯霉素抗性（Cm）片段。以上述纯化的PCR产物为模板，以rbsC-UF/rbsC-DR引物，运用重叠PCR技术，扩增用于rbsC突变的打靶片段。将构建的打靶片段电转化至含有pKD46质粒的DE17ΔluxS感受态细胞中，将细菌在900 μL SOC培养基中稀释，37℃孵育1 h后涂布于含有30 μg/mL Cm的LB平板上。孵育24 h后，挑取氯霉素抗性的克隆，用引物对rbsC-inF/rbsC-inR、rbsC-outF/rbsC-outR通过PCR鉴定rbsC基因缺失株，运用pCP20质粒将缺失株氯霉素抗性敲除，并命名该双缺失株为DE17ΔluxSΔrbsC。

1.5 测定细菌生长曲线，运动性和生物被膜形成能力 根据文献[9]描述测定突变株DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC的生长曲线。将菌株DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC分别在含有LB的试管中培养至OD600值为1.0，然后将等量的细菌培养物以1∶100（v/v）的比例转移至培养瓶中，在37℃条件下振荡培养。使用分光光度计每隔1 h监测培养物的OD600，并记录结果，试验重复3次。根据文献[10]描述的方法进行运动性试验。将在液体LB中培养至OD600值为1.0的菌液离心沉淀后用无菌PBS洗涤3次，沉淀用无菌PBS重悬，取2 μL的细菌悬浮液涂布在0.25%软琼脂平板上，37℃培养过夜，通过测量细菌迁移直径来评估其运动性。

参照文献[11]使用结晶紫染色法测定DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC的生物被膜形成能力。菌株DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC培养至对数生长中期，4℃离心收集菌体，用无菌PBS洗2次，用M9（含0.2%果糖）重悬菌体，并调整菌液OD600值为1.0，稀释10倍后加入到96孔板中，每孔200 μL，每组作8孔重复，同时用无菌的培养基作为阴性对照组。37℃培养24 h，将每孔中的培养基吸出，用PBS清洗2次后烘箱固定20 min，每孔加入0.1%结晶紫溶液200 μL，37℃温箱染色15 min，PBS洗涤3次，倒置晾干。每孔加入95%乙醇200 μL充分溶解后，用酶标仪测定OD595的吸光值。

1.6 黏附与入侵 参照文献[3]中描述的方法，运用DF-1细胞对DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC进行细菌黏附和侵袭能力测定。在37℃、5% CO2培养箱中温育20 h后，分别感染0.01接种于24孔细胞培养板培养箱中的DF-1细胞MOI DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC。继续在37℃、5% CO2孵育2 h后，用PBS洗涤3次，用0.5% TritonX-100裂解细胞，将细胞裂解物10倍法稀释并挂线在LB平板上进行细菌计数，计算细菌对细胞的黏附率。对于入侵率的测定，参照黏附的方法进行细菌黏附细胞后，将含有100 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基加入24孔细胞培养板中作用1 h以杀死细胞外细菌，裂解细胞后，计算细菌对细胞的入侵率。

1.7 半数致死量（median lethal dose, LD50）的测定 参照文献[12]描述的方法略做改动进行LD50的测定。将购买的7日龄三黄鸡随机分成10组，每组8只，用于计算菌株DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC的LD50。将菌株DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC涂布于LB平板上，37℃静置培养过夜后，无菌PBS冲洗下细菌，将菌液转至15 mL离心管中，4℃、5500×g离心10 min，弃上清液，用无菌的PBS洗2次，调整OD600值为1.0，分别将菌液稀释至5×107CFU/mL、5×106CFU/mL、5×105CFU/ mL、5×104CFU/mL和5×103CFU/mL，攻毒剂量为0.2 mL，肌肉注射7日龄的三黄鸡腿部。连续观察7 d，记录死亡数，采用改良寇氏法计算LD50。

1.8 体内载菌量 16只7日龄三黄鸡被随机分成2组，用于评价感染DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC后其体内的载菌量。将菌株DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC分别涂布于LB平板上，37℃静置培养过夜后，无菌PBS洗脱，将菌液转至15 mL离心管中，4℃、5500×g离心10 min，弃上清液，用无菌PBS洗2次，调整OD600值为1.0，将菌液稀释至5×106CFU/mL，肌肉注射7日龄的三黄鸡腿部，每组8只，攻毒剂量为每只0.2 mL。观察24 h后采血，处死后取内脏，在无菌操作台内将鸡的肝脏和脾脏组织加入称量好的1.5 mL无菌离心管中，称取总重后研磨，10倍法稀释后取20 μL涂布LB平板，37℃培养12 h后记录单菌落数。

2 结果

2.1 DE17ΔluxSΔrbsC双缺株的鉴定 以DE17ΔluxS为阳性对照，用外侧引物rbsC-outF/rbsC-outR扩增rbsC基因，预期在DE17ΔluxS中可以扩增到大小为1587 bp的条带，DE17ΔluxSΔrbsC中能扩增到大小为754 bp的条带。结果显示，DE17ΔluxS株能扩增到约为1500～2000 bp条带，双缺失株扩增到约为750 bp的条带，符合预期结果（图1）。用内侧引物rbsC-inF/rbsC-inR扩增rbsC基因，预期在DE17ΔluxS中可以扩增到564 bp的条带，DE17ΔluxSΔrbsC中不能扩增到该条带。结果显示，DE17ΔluxS中可以扩增到约为600 bp的条带，双缺失株未扩增出条带，符合预期结果。内外侧引物鉴定结果表明，双缺株DE17ΔluxSΔrbsC构建成功（图1）。

图1 DE17ΔluxSΔrbsC双缺株鉴定结果Fig.1 PCR identification of double mutant DE17ΔluxSΔrbsC

2.2 生长曲线、运动性和生物被膜形成能力的测定结果 生长曲线结果表明，DE17ΔluxS和双缺株DE17ΔluxSΔrbsC的生长特性几乎一致，表明rbsC缺失后对DE17ΔluxS缺失株的生长不产生影响（图2A）。通过监测各菌株在运动培养基上的运动情况可知，DE17ΔluxS的运动能力显著强于DE17ΔluxSΔrbsC的运动能力（P＜0.01），具有统计学意义，表明rbsC对APEC的运动性起重要作用（图2B）。用结晶法检测生物被膜形成能力，结果显示，DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC株生物被膜形成能力差异不显著，不具有统计学意义（P＞0.05），表明rbsC对DE17ΔluxS的生物被膜形成能力无明显影响（图2C）。

图2 DE17ΔluxSΔrbsC的生物特性分析Fig.2 The biological characteristics of DE17ΔluxSΔrbsC

2.3 黏附与入侵能力检测结果与分析DE17ΔluxS株和DE17ΔluxSΔrbsC株黏附能力分别为5.35×106CFU/孔和2.51×106CFU/孔，DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC株的入侵能力分别为6.15×104CFU/孔、1.77×104CFU/孔。结果表明，与DE17ΔluxS相比，DE17ΔluxSΔrbsC的黏附能力和入侵能力分别降至46.92%和28.78%，结果见图3。

图3 rbsC基因缺失对DE17ΔluxS黏附入侵能力的影响Fig.3 The effects of rbsC on the abilities of adherence and invasion of DE17ΔluxS to DF-1 cells

2.4 半数致死量（LD50）的测定结果 动物试验结果显示，DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC的LD50分别为4.53×103CFU和5.23×105CFU（表2），表明与DE17ΔluxS株相比，双缺株DE17ΔluxSΔrbsC对7日龄的三黄鸡致病性显著下降，毒力下降了115.5倍。

表2 DE17ΔluxS和DE17ΔluxSΔrbsC的LD50测定结果Table2 Calculations of LD50 for DE17ΔluxS and DE17ΔluxSΔrbsC strains

2.5 体内载菌量结果与分析 按照5×106CFU的攻毒剂量，对7日龄的三黄鸡进行腿部肌肉注射，24 h后心脏采血并无菌解剖计算不同菌株的体内载菌量。结果表明，DE17ΔluxS在肝脏和脾脏的载菌量分别为1.05×105CFU/g、2.75×106CFU/g，每毫升血液载菌量为6.27×105CFU/mL。DE17ΔluxSΔrbsC在肝脏和脾脏的载菌量分别为2.89×104CFU/g、3.47×104CFU/g，血液载菌量为295 CFU/mL与DE17ΔluxS相比，DE17ΔluxSΔrbsC在肝脏、脾脏和血液中的带菌量分别下降了3.63倍、79.20倍和2124.41倍，说明rbsC基因缺失后DE17ΔluxS降低了细菌在动物体内的载菌量（图4）。

图4 细菌载菌量Fig.4 Assessment of bacterial loads in vivo

3 讨论

APEC感染家禽引起的大肠杆菌病给养禽业造成严重的经济损失，同时也对食品安全构成威胁[13]。目前主要是使用抗生素防控该病，但由于耐药突变菌株的出现使得一些抗生素无效[14]。因此通过疫苗，尤其是减毒活疫苗控制APEC是今后主要的防控方式之一。研究表明，APEC菌株可通过缺失毒力基因而减毒，例如TonB、luxS、ibeA[3,15-16]。RbsC蛋白参与大肠杆菌核糖转运，目前未见其是否参与调控APEC毒力的相关报道。有研究表明，双基因缺失菌株的生物安全性优于单一缺失[4]，如APEC中的cya和crp突变[17]。本实验室前期研究表明，luxS基因在APEC的致病性中发挥重要作用[3]。本研究以APEC菌株DE17的luxS单基因缺失株为基础，进一步构建了luxS和rbsC的双基因缺失株，通过对DE17ΔluxSΔrbsC生物特性的分析，为评价该双缺株作为减毒疫苗及其减毒机制提供参考。

本研究表明rbsC缺失对DE17ΔluxS的生长特性无显著影响，但与DE17ΔluxS相比，双缺失株的细菌运动性显著下降（P＜0.05），这可能是因为RbsC是核糖转运蛋白，缺失会使细菌核糖转运能力下降，影响细菌能量的供应。生物被膜形成能力无显著变化，可能是由于rbsC的缺失没有影响到DE17ΔluxS上与生物被膜形成相关的基因，也可能是rbsC缺失后细菌通过其他代偿通路发挥其功能，具体机制仍有待进一步研究。

细菌对宿主细胞的黏附和侵袭在定植中起关键作用，被认为是微生物感染发病机理的第一步[4]。与DE17ΔluxS相比，DE17ΔluxSΔrbsC黏附入侵宿主细胞的能力也显著下降（P＜0.05），这可能与细菌的运动性下降有关，还有可能是因为rbsC和luxS基因的缺失导致某些参与宿主细胞的黏附和入侵基因的下调，如在APEC中ibeA基因的缺失，会导致fimC和温度敏感血凝素基因tsh的下调[18]。此外，双缺株在动物体内的定植能力进一步下降，主要表现在血液、肝脏和脾脏中的载菌量明显降低（P＜0.05），尤其在血液中的带菌量比DE17ΔluxS降低了2124.41倍，可能是由于rbsC基因的缺失，降低了细菌部分毒力基因的表达，也可能影响了部分生物学特性，比如运动性减弱等导致感染性降低，进而减弱了在宿主血液和组织的定植能力。半数致死量LD50检测结果进一步表明，与DE17ΔluxS相比，DE17ΔluxSΔrbsC株的毒力下降了115.5倍，其毒力的降低与运动性和黏附入侵能力的降低必然有关，但是否与已鉴定的APEC中的8种毒力基因（tsh、ompA、vat、iucD、pfs、fyuA、fimC、iss）的下调有关还有待进一步研究。本研究表明rbsC基因与APEC的致病性相关，与DE17ΔluxS相比，双缺失株DE17ΔluxSΔrbsC毒力显著下降，本研究为后续开展DE17ΔluxSΔrbsC作为减毒疫苗及其减毒机制研究提供参考。