侵袭性真菌病非培养诊断技术的现状及进展

杨玉琪，刘家云，徐修礼，周柯，周磊，孔美娟，张鹏亮

（空军军医大学西京医院检验科，陕西西安 710032）

真菌广泛存在于自然环境中，一般在正常情况下不会对人体造成直接感染。但对于免疫缺陷或者长期接受免疫抑制治疗的患者，真菌造成的感染却是其常见的并发症之一[1]。近年来，随着皮质激素、免疫抑制剂、各种广谱类抗生素的大量应用，以及器官移植、各种侵入性检查和治疗技术的开展，临床深部真菌感染日益增多且趋向复杂化，常导致致死性感染，病死率极高，对患者健康造成极大威胁[2]。早期、快速诊断是侵袭性真菌感染患者得到有效治疗、降低死亡率的关键因素。

目前，非培养技术既是一门传统技术，也是一门新兴技术，是国内外侵袭性真菌病诊断研究的热点，其技术路线主要是基于免疫学原理的血清学方法和以PCR技术为基础的分子生物学方法[3]。血清学诊断主要包括抗体检测及抗原、代谢产物检测两大类。目前，部分血清学方法已经较为成熟，敏感性及特异性均较高，已应用于隐球菌病、曲霉病、念珠菌病以及组织胞浆菌病等侵袭性真菌感染的诊断，如1,3-β-D-葡聚糖试验（1,3-β-D-glucan，G试验）、半乳甘露聚糖试验[4-5]（galactomanna，GM试验）等。同时，分子生物学方法的飞速发展为临床真菌的诊断开辟出了一条新的途径。现就非培养技术的实验室诊断研究现状及进展予以综述。

1 G试验

1.1 G试验的检测原理和意义

G试验是检测真菌的细胞壁成分1,3-β-D葡聚糖，其可特异性激活鲎变形细胞裂解产物中的G因子，活化的G因子又可使凝固酶原转化为凝固酶，通过旁路途径激活鲎试验，从而产生凝集反应[6]。该方法具有快速、操作方法简单等特点，适用于隐球菌、接合菌以外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌引起的感染，可以及时有效地弥补常规诊断技术的缺陷[7]。

1.2 G试验的检测方法

用以测定G试验的方法主要有凝胶法、浊度法和显色法。凝胶法是通过使鲎试剂产生凝集反应的原理来定性检测或半定量测定真菌1,3-β-D葡聚糖或细菌内毒素的方法，通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。该法操作比较简单、经济，不需要专用测定设备，但只能进行定性或半定量测定，在临床上的使用价值不高，故现已基本淘汰。浊度法又分为动态浊度法和终点浊度法，其通过检测浊度增加的速度或反应混合物的浊度上升至预先设定的吸光度所需要的反应时间来测定真菌1,3-β-D葡聚糖或细菌内毒素的含量。显色法又可分为动态显色法和终点显色法，是利用鲎试剂与1,3-β-D葡聚糖或内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色，根据释放出的呈色团的数量来测定真菌1,3-β-D葡聚糖或细菌内毒素的含量。浊度法和显色法因操作简单、快速、灵敏度高、检测范围较宽，是目前国内外进行真菌1,3-β-D葡聚糖或细菌内毒素检测常用的方法[8]。但是，因为所使用的试剂原料来源、对样本处理和检测方法的不同，使其临床诊断价值也不完全相同，见表1。

表1 国外不同G试验检测方法对比

1.3 G试验的影响因素

由于G试验基于免疫学原理的固有属性，影响其检测结果的因素较多，从而导致检测结果出现较高的假阳性和假阴性等问题。假阳性或假阴性情况的产生，主要来源于检测方法的局限性。污染、静脉制剂、肝硬化患者，使用抗肿瘤类药物或者磺胺类、头孢菌素类等药物，甚至食用蘑菇类食物等，都会造成检测结果出现假阳性的情况；而感染隐球菌或者接合菌，使用某些抗真菌药物如卡泊芬净，以及标本室温下放置时间过长等，都会造成检测结果出现假阴性的情况。为了确保检测结果的准确性，应对实验各个环节的质量加以控制。在采集标本时应做到无菌操作，并使用专用的无热原真空采血管，采集后应及时送检并及时检测；对于常规患者应在早上用药治疗前空腹情况下进行采血；对于黄疸、溶血、乳糜标本，建议重新采血复查。进行样本检测前，需要首先制备合格的标准曲线，用以进行仪器的校准和室内质控；另外，在更换试剂批号时，应重新定制标准曲线。在样本的处理检测过程中，应避免操作过程中微生物的污染，同时确保使用器具无菌、无致热原，并按照使用说明书进行标准操作。

2 GM试验

2.1 GM试验的检测原理和意义

GM试验是检测曲霉菌细胞壁上的一种多聚糖抗原（即半乳甘露聚糖抗原），主要适用于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断。据报道，有2/3的患者在其他诊断方法阳性之前6～14 d即可检测到GM。另一方面，GM的释放量与菌量成正比，可以反映感染的严重程度，连续检测GM也可作为治疗疗效的监测[8]。

2.2 GM试验的检测方法及影响因素

目前，用以检测GM试验的检测方法主要有ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附试验）、RIA（Radioimmunoassay，放射免疫分析试验）和乳胶凝集试验，其敏感性和特异性也因试验方法的不同而异。ELISA方法已在临床上使用了二十多年，其敏感性高于乳胶凝集试验，成为最常用的检测GM的方法之一。当然，ELISA方法检测半乳甘露聚糖也具有局限性。据报道，GM试验的假阳性率为10%～15%，主要见于以乳制品为主食的婴幼儿、异体骨髓移植患者、菌血症患者、自身抗体阳性及接受白蛋白或者免疫球蛋白治疗的患者，或见于使用半合成青霉素的患者等[9]。同时，GM试验也具有一定的假阴性，主要见于使用抗真菌药物、局部感染导致释放入血的半乳甘露聚糖不持续以及非粒细胞缺乏患者等情况。

3 G试验和GM试验联合检测的临床应用

虽然，G试验和GM试验均会受多种因素影响从而出现假阳性的结果，影响其诊断效力。但因G试验和GM试验具有不同的特点，引起其假阳性的因素也有所不同，具体如表2所示。将G试验和GM试验联合检测可最大程度地降低假阳性率[10]，从而可以更有效地诊断侵袭性曲霉菌的感染。

4 分子生物学方法应用于临床真菌的诊断

随着以G试验和GM试验为代表的血清学诊断方法越来越广泛的使用，其暴露出的血清学诊断方法的不足也越来越明显，临床上假阳性和假阴性的报告也屡见不鲜[11-12]。近年来，分子生物学方法的飞速发展为临床真菌的诊断开辟出了一条新的途径。分子生物学方法的核心技术主要有核酸分子杂交技术和核酸扩增技术，其在真菌临床检验的应用主要有两大优势：（1）分子生物学方法可以对真菌的菌种进行鉴定，尤其是形态学上难以区分确认的新种；（2）分子生物学方法可以直接检测人体中真菌的感染情况[13]。利用真菌通用引物，通过PCR扩增技术，可以准确地鉴定不同种致病性真菌的种类，对于种类繁多、分类学上鉴定有局限性的菌株尤为适用。

5 结语

目前，虽然已有侵袭性真菌病诊断指南的出台，但其临床体征与表现存在不确定性，病情进展迅速且严重，难以预知，临床医师及实验室人员诊断侵袭性真菌病面临很大的挑战和困难。虽然直接镜检、培养及病理学检查仍是侵袭性真菌感染诊断的金标准，但早期、特异性地区分高危人群人体组织中处于定植及致病性的丝状真菌也是侵袭性真菌感染诊断急需解决的问题。目前，基于免疫学原理的血清学方法和以PCR技术为基础的分子生物学方法等非培养方法虽然有了较大发展，但同时其试验也充满各种不足，还具有很大的发展空间和挑战。因此，立足并不断改良现有侵袭性真菌病的传统诊断学方法，结合血清学方法和分子生物学方法等早期、快速的诊断方法，合理使用高分辨CT等先进的影像学诊断技术，是目前早期、准确地诊断侵袭性真菌病的最佳途径，可以满足临床治疗的迫切需求。