6种野生金花茶叶表皮微形态特征及其系统学意义

朱栗琼 覃冬梅 招礼军* 邓斌胜 刘晟源 蒋昌杰

（1. 广西大学林学院，广西森林生态与保育重点实验室，南宁 530004；2. 崇左市林业科学研究所/崇左市园林科学技术研究所，崇左 532200；3. 广西弄岗国家级自然保护区管理局，龙州 532400；4. 南宁市金花茶公园，南宁 530022）

金花茶组（Sect.Chrysantha）为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）常绿灌木或小乔木植物，主要分布于我国广西、云南及越南交界处较窄范围，常生长在阴凉、潮湿、阳光不能直射的山林中，伴生于热带性树种林下［1］，是我国珍稀濒危植物。金花茶组植物因花色金黄，具有“茶族皇后”的美誉，是培育黄色系山茶花的优良遗传基因资源，同时其体内含有黄酮、茶多酚、多种氨基酸、维生素以及微量元素等，具有较高的营养和药用价值。因此，引发了研究者的兴趣，在金花茶资源调查［2～3］、形态［4］、分类［5～7］、遗传［8～9］、繁育［10～11］、化学成分［12］等方面均有研究报道。在形态解剖学方面，主要从叶片横切面及表皮特征出发，寻找金花茶种间差异，以此作为分类依据，如邹琦丽［13］对9 种金花茶叶解剖发现叶表皮细胞有多角形和不规则形两种类型；王任翔等［14～15］用扫描电镜观察了20种金花茶叶表皮微形态特征，在气孔外拱盖表面和内缘、角质膜等发现了具有分类意义的性状；李凤英等［16］在金花茶25个分类群叶下表皮中发现角质膜、细胞垂周壁式样及气孔形状等特征有一定分类学意义。植物叶表皮的微形态特征被认为在同一地理分布区域内表现出较强的一致性，可作为属种间的分类依据［17～18］。叶的形态结构受环境影响较明显，因此用原产地的野生种来研究叶表皮的微形态特征保守性和可靠性更强。本研究以金花茶原生地广西弄岗国家级自然保护区的6 种野生金花茶的成熟叶片为对象，从叶表皮微形态的观察和数量特征统计出发，比较6种野生金花茶种类之间的差异性，并探索各种间的亲缘关系，为金花茶的分类学基础研究提供理论依据，同时探讨了该6种金花茶叶片微形态特征对当地特殊环境的响应策略，为制定野生金花茶的保育措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 样地基本情况

实验材料采自广西西南部崇左市的弄岗国家级自然保护区，地理位置106°42′28″～107°4′54″E，22°13′56″～22°39′9″N，属于裸露型喀斯特区域，主要由“峰丛—洼地”镶嵌而成，石山峰海拔400～500 m，隶属于北热带季风气候，年均温22℃，极端最高温40.5℃，极端最低温-3℃，≥10℃的年积温7 834℃，年均降雨量1 150～1 550 mm，干湿季明显，其中5～9月为雨季，土壤以棕色和黑色石灰土为主。

本研究以保护区自然生长的6 种野生金花茶为材料，分别是凹脉金花茶（Camellia impressinerv‐is，IM）、薄叶脉金花茶（C. chrysanthoides，CH）、毛籽金花茶（C.ptilosperma，PT）、柠檬黄金花茶（C.li‐menia，LI）、弄岗金花茶（C. longgangensis，LO）、四季金花茶（C.perpetua，PE）。每个种类各选择5 株长势中等的样树，在东南西北四个方向选取中部枝条，分别剪取顶芽下5～7节的成熟健康叶片，用FAA液固定。

1.2 制片方法

表皮离析片的制作：剪取叶片近中部叶脉两侧部分约0.5 cm×0.5 cm 小块样品，将其浸泡于等量的30%过氧化氢溶液和醋酸溶液中，置于60℃水浴锅中3 h，蒸馏水漂洗后再用次氯酸钠溶液离析至透明，再次漂洗干净，撕取表皮，装片，于NikonE200光学显微镜下观察、拍片及测量。测量和计算指标有：气孔长度、气孔、气孔、指数［气孔数/（气孔数+表皮细胞数）］和上、下表皮细胞密度。

扫描电镜制片：剪取固定好的叶片近中部叶脉两侧约0.5 cm×0.5 cm 的小方块，蒸馏水漂洗后，每隔15 min 用磷酸缓冲液冲洗1 次，重复3 次。再每隔10 min 进行1 次乙醇脱水，乙醇梯度变化为：50%—70%—80%—90%—100%，脱水自然干燥后取出，粘台，喷金，于Phenom Pro 800-07334 扫描电子显微镜下观察和拍照。

1.3 数据分析

数据分析以及制图均用SPSS 20.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 叶表皮显微形态特征

光学显微镜下，发现6种金花茶的叶片气孔均分布在远轴面（下表皮），近轴面上未见气孔的出现，上、下表皮细胞均为不规则状，垂周壁都出现浅波至深波不等的起伏，每种上表皮细胞形状及大小较均匀，下表皮细胞组成大小不一；所有种类的气孔器均由3 个大小不等的副卫细胞及2 个肾形的保卫细胞而成，属环列型气孔，气孔器呈宽椭圆形，而张开的气孔为椭圆形，但气孔长轴与短轴比例种间有所不同，另外在种间上还存在保卫细胞两级的T 型加厚具明显和不明显两种类型（见图1）。6 种金花茶叶的表皮细胞及气孔器的形态特征见表1。

表1 6种金花茶叶表皮细胞及气孔器显微形态特征Table 1 The features of leaf epidermal cells and stomatal apparatus of six golden camellia species

2.2 叶片表皮超微形态特征

扫描电镜下观察发现，6 种金花茶上、下表皮细胞形状不规则，大小不等，凹凸也不一致，气孔随机分布，除四季金花茶的上、下表皮细胞的轮廓不清楚外，其余五种表皮细胞轮廓均清晰可见（见图2～3）。表皮细胞平周壁除四季金花茶的上表皮与细胞持平，柠檬黄金花茶下表皮向上突起外，其余的均呈下陷状；下表皮角质层纹饰分为两类，一种是辐射状，包括毛籽金花茶和弄岗金花茶，其余的皆为线状。所有种类表皮细胞外蜡质层均有不同程度的丝状饰纹，有的还分布有链状、絮状或颗粒状饰纹，比较特殊的是四季金花茶上表皮蜡质层还有乳突、下表皮蜡质层还有痂状饰纹。6 种金花茶叶表皮超微形态特征见表2。

表2 6种金花茶叶表皮细胞轮廓和饰纹超微形态特征Table 2 The ultra-structure of leaf epidermal cells and ornamentation of six golden camellia species

扫描电镜下观察气孔器及其外拱盖特征见表3。从图2～3 中可看出，金花茶气孔器呈近圆形或椭圆形，气孔器镶嵌于下表皮细胞位置有两种状态，其中凹脉金花茶、薄叶金花茶、毛籽金花茶和弄岗金花茶气孔器与表皮细胞位置相持平，而柠檬金花茶和四季金花茶气孔器则呈下陷状。6 种金花茶气孔器外围角质层均有饰纹，但饰纹类型不同，凹脉金花茶为单层不完全环形，薄叶金花茶为多层不明显环形，毛籽金花茶、柠檬黄金花茶、弄岗金花茶呈环形，四季金花茶的饰纹有两层，外层左右各一条呈括弧状，与气孔长轴方向一致，内层呈环形；气孔外拱盖表面除四季金花茶的为粗糙型外，其余的皆为近平滑型，而气孔外拱盖内缘形状，除凹脉金花茶为较平直外，其余的皆为浅波状。

表3 6种金花茶气孔器及气孔外拱盖超微形态特征Table 3 The ultra-structure of stomatal apparatus and outer stomata ledge of six golden camellia species

2.3 6种金花茶叶表皮特征数值比较

叶片表皮包括表皮细胞和气孔两部分，本研究所测6 种金花茶叶表皮细胞及气孔的相关数量特征及统计结果见表4。

表4 6种金花茶叶表皮细胞及气孔数量特征Table 4 The quantitative features of leaf epidermal cells and stomata of six golden camellia species

气孔长度变化范围是12.28±0.34～15.57±0.16 μm，除四季金花茶显著小于（P＜0.05，下同）其它五种外，其它五种间差异不显著（P＞0.05，下同）；气孔宽度在8.14±0.25～9.85±0.18 μm，薄叶金花茶、毛籽金花茶、柠檬黄金花茶和弄岗金花茶的气孔宽度相对较大，四个种之间差异不显著；凹脉金花茶和四季金花茶，这两种都显著小于其它四种，且两者间差异亦显著；气孔密度的变化范围是149.64±5.00～246.57±4.47 个·mm-2，密度最高的是薄叶金花茶，除该种与凹脉金花茶两者之间差异不显著，其余各种之间差异均显著。气孔指数在12.98%～20.93%之间变化，四季金花茶最大，弄岗金花茶最小。

6 种金花茶叶表皮细胞密度都是上表皮大于下表皮，说明上表皮细胞普遍比下表皮细胞小，其中上表皮细胞密度变化范围是2 002.77±31.68～3 266.90±48.09 个·mm-2，密度最高的是薄叶脉金花茶，最小的是弄岗金花茶，弄岗金花茶与柠檬黄金花茶间的上表皮细胞密度差异不显著，其它种类之间差异显著；下表皮细胞密度的变化范围在802.64±21.73～1 550.87±28.27 个·mm-2，薄叶金花茶密度最大，而且与其余五种存在显著差异，密度最小的是柠檬黄金花茶，除与四季金花茶间的差异不显著外，与其它种类的差异显著，凹脉金花茶、毛籽金花茶、弄岗金花茶，三者之间差异不显著。

2.4 6种金花茶叶表皮数量特征聚类分析

聚类分析可根据遗传距离的长短来分析各性状指标之间的相关性，亲缘关系较近的种类常聚为一类［19］，可用于优良性状的选育工作。本研究采用上述6 个叶表皮数量特征进行Euclidean 距离聚类分析，从聚类树状图可以看出弄岗金花茶和毛籽金花茶距离最小，表明两者的亲缘关系最近，四季金花茶与其它种的遗传距离最大，表明其与它们的亲缘关系最远，其余种间的亲缘关系位于之间。以类别最小相关系数为分类标准，6种野生金花茶可分为五类，其中弄岗金花茶（LO）和毛籽花茶（PT）聚为一类，距离系数为2.407，两者在气孔长、宽及下表皮细胞密度差异不显著，同时两者表皮细胞的蜡质纹饰、角质层纹饰及气孔外盖特征具有高度相似性，特别是下表皮角质层纹饰，两者辐射状粗条纹与其它种类的线状纹饰具明显区别，其余四种金花茶在各测量和观察特征规律性不明显，所以可自成一类（见图4）。

3 讨论

3.1 叶表皮微形态特征在植物分类中的应用

大量研究表明，叶表皮微形态特征是植物系统分类及演化趋势分析的重要指标，无论是在种间、属间，甚至是科级水平的分类上应用均有相关报道［17--24］，报道中涉及的常用指标主要有：表皮角质膜、蜡质饰纹、表皮细胞大小和形态、垂周壁式

样、气孔器类型、气孔大小、密度、指数及气孔盖特征等。本研究用上述指标对6 种金花茶的研究结论与王任翔等人［14～16］的研究相比较，相同之处有：表皮细胞形状不规则，垂周壁弯曲；气孔仅分布于下表皮，气孔器近圆形，具有3 个大小不一的副卫细胞，属环列型气孔。相同的结果一方面说明这些特征是金花茶组植物的共性，另一方面说明这些特征比较保守，受环境影响较小，可以考虑作为种以上水平的分类依据。研究结果差异较大的有：气孔密度、气孔外拱盖角质膜和蜡质饰纹等特征。李凤英等人［14～16］在研究金花茶组时这几个指标也具有差异性。实际上除金花茶组植物外，其它植物类群中也有类似报道［22，25］，说明叶表皮这些属性受环境影响较大，具有一定可塑性，在利用它们作为分类依据时要注意结合样地环境因子综合考虑。

除上述共性之处，本研究利用扫描电镜观察到6种金花茶叶表皮微形态还有各自的特征，对该六种金花茶分类有一定参考意义。如：凹脉金花茶叶下表皮蜡质纹饰有较长的链状和絮状纹饰；薄叶金花茶叶的气孔外拱盖角质层有多层，使得外拱盖角质层平面呈浅波浪状；柠檬黄金花茶叶下表皮蜡质饰纹的丝状体最短；毛籽金花茶和弄岗金花茶上表皮的蜡质纹饰为长丝状，并附有较多絮状体或颗粒状纹饰，但两者在下表皮细胞的垂周壁式样及气孔密度上有一定差异；四季金花茶的气孔外拱盖角质层独有两层，蜡质纹饰除丝状体外，上表皮的还有乳突结构，下表皮还有痂状体结构。

角质层纹饰在不同类群间差异较大，常被研究者用来作为植物分类的重要指标［20，23，26］，本研究发现6 种金花茶叶表皮细胞上覆盖的蜡质纹饰普遍具有长短不一的圆柱状或链状丝状体，这是前期研究者没有报道过的特征，可考虑作为野生种与栽培种金花茶组区分的依据。

3.2 6种金花茶的亲缘关系

6 种金花茶叶表皮细胞及气孔密度、大小等6个数量指标均存在不同程度的差异，差异显著（P＜0.05）者在种间对比中可以作为分类的依据；用该6 个指标对6 种金花茶进行聚类分析，结果表明：毛籽金花茶和弄岗金花茶聚为一类，其余的4种各为1 类。相同或相近的特征意味着物种间具有较密切的亲缘关系，不同特征的差异性表示种间亲缘关系的远近和进化的程度。毛籽金花茶和弄岗金花茶的叶表皮形态指标大部分较相似，特别是下表皮角质层辐射状粗条纹纹饰明显不同于其它四种，因此本研究支持将毛籽金花茶和弄岗金花茶归并为一种的观点［16，27］，施苏华等［8］采用RAPD分子标记方法的研究也表明毛籽金花茶和弄岗金花茶的亲缘关系较近，从遗传学角度支持将两者归并。与这两个种亲缘关系较近的是凹脉金花茶，但就表皮细胞形状来看，具有深波状垂周壁的凹脉金花茶其进化程度要高于前两者。四季金花茶因聚类距离系数的差距最大及其具有较多独特的微形态特征，表明与其它五种间具有明显的分化和较远的亲缘关系。其它两种金花茶的亲缘关系居于凹脉金花茶和四季金花茶之间。

3.3 金花茶叶表皮微形态特征与其环境适应性

叶片形态在某种程度上反映了植物对环境的适应性及环境对植物形态发育的调控结果。有研究已证实，叶片的微形态特征与植物的抗逆性有直接或间接关系［28～29］。本研究采样地位于北回归线以南，属于典型的喀斯特地貌类型，土层浅薄、岩石裸露、表层储水能力差，年平均温度和年积温较高，植物必须具有一定的保水能力才能在旱季生存和延续；从观察中可以看到，6 种金花茶叶表皮均具有一些适应干旱环境的特征，具体反映在如下几个方面：气孔仅分布于下表皮，避免了光线直接照射，降低了植物对水分的蒸腾作用，利于对水分保存；叶片上表皮具有较明显的角质层和蜡质层覆盖，此两类物质均为脂类化合物，既能减少叶片内部水分过渡流失，又不影响光线进入叶肉组织［30］，保障光合作用正常进行；表皮细胞壁均较厚，既能增强叶片支持力和致密度，同时可以削弱水分的渗透散发，防止叶片因缺水而萎蔫；部分种类的下陷气孔也是减弱外界高温气流直接进入叶片内部的一种抗旱适应性特征。综上所述，6种金花茶的叶片形态及结构特征对当地生态环境具有较好的适应策略，同时反映了其结构与功能的统一性。