六种蜂蜜的孢粉学和淀粉酶活性分析

杨 娟，黄新球，曾钦薇，雷树明

（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101）

蜂蜜是重要的蜂产品之一，蜂蜜理化指标对划分蜂蜜等级极具意义。蜂蜜属性取决于工蜂采集植物的种类及其在蜂巢内的加工程度。蜂蜜质量等级的划分决定了蜂蜜本身的价格及价值，因此，为了更好的明确蜂蜜属性，本次研究中采用孢粉学及淀粉酶值活性法划分云南六种特色蜂蜜的理化属性。

蜂蜜孢粉学[1]是通过检测蜂蜜样品中花粉的种类与比例，进行科学的统计与分析，能够得出主要蜜源植物与辅助蜜源植物，以确定蜂蜜是否为表称产品。Louveaux 等人根据蜂蜜中的每一种花粉粒个数所占的百分比（P），可分为主要花粉(dominant pollen，P≥45%)，次要花粉(secondary pollen，16%≤P＜45%)，少量花粉(important minor pollen，3%≤P＜16%)和微量花粉(minor pollen，P＜3%）[2]。史琦云等[3]采用醋酸酐分解法研究了15 种蜂蜜中的花粉粒，结果表明，根据所含主要花粉形态和数量可判定是否为单种蜜或混合蜜。用花粉检验法可以作为生产实践中鉴定真伪蜜的科学有效方法。

蜂蜜中酶的含量是检验蜂蜜质量的一个重要指标，决定了蜂蜜的成熟度、新鲜度、营养价值的高低[4]。蜂蜜的淀粉酶活性通常用淀粉酶值表示，吕成军[5]采用分光光度法测定纯蜂蜜和掺假蜂蜜的淀粉酶值，认为淀粉酶值是检测蜂蜜质量好坏的一个重要指标，且淀粉酶值越高、品质越好。此外，蜂蜜的淀粉酶值也可以作为鉴别蜂蜜是否掺杂、掺假的依据，陈宜君等[6]鉴别118 件蜂蜜样品的真假，指出掺假蜂蜜淀粉酶活性值显著低于真蜜，且几乎为零。淀粉酶值对鉴别蜂蜜质量具有灵敏性，易判断。

本次研究中，我们拟采集一周年中盛花期里蜂场内的蜂蜜，以孢粉学和淀粉酶值检测，以期反映出蜂蜜的质量，可为蜂蜜质量优劣评价方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

样品来源：蜂蜜样品取自国家蜂产业技术体系红河综合试验站示范蜂场，当蜂场周边的苕子花、石榴花、鬼针草花、益母草花、野藿香花、野坝子花进入大流蜜期时用样品采集吸管吸取巢脾中的蜂蜜，样品标为1#、2#、3#、4#、5#、6#。

主要仪器：AL204 分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司；XYJ-A 电动离心机，常州澳华仪器有限公司；HHS-4S 恒温水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；BM12-C 数码生物显微镜，上海光学仪器厂；722S 可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

供试药剂：冰乙酸，醋酸酐，浓硫酸，碘，碘化钾，乙酸钠，氯化钠，可溶性淀粉等试剂均为分析纯，实验用水为GB/T 6682 规定的一级水。

1.2 试验方法

1.2.1 蜂蜜孢粉学测定方法

蜂蜜样品前处理：蜂蜜的孢粉学分析采用改良的醋酸酐分解法[7]，精确称量蜂蜜样品10.00 g，用20 mL 30℃的蒸馏水溶解。离心处理，3000 r/min 离心10 min，弃上清液；加入2 mL 冰乙酸，摇匀，静置2h；再次离心，3000 r/min 离心10 min，弃上清液。加入新配制的醋酸酐-浓硫酸(9: 1)混合液1 mL，85℃下水浴8 min。取出后冷却待检。

蜂蜜中花粉的种类和百分比(pollen type and percent)测定：取干净的载玻片，于载玻片中心处滴入一滴样液，盖上盖玻片，先于16×4 倍视野下查找花粉粒位置，然后在16×10 倍显微镜下观测，每张玻片观察10 个视野，对照制备好的蜜源植物花粉图片，鉴别蜂蜜中的花粉种类，同时记录每个视野中各种花粉的个数，得出蜂蜜中花粉的种类和每种花粉所占百分比。不同的蜂蜜样品需要做3 次平行实验，花粉率计算见式（1）

1.2.2 淀粉酶活性测定方法

蜂蜜中淀粉酶值测定方法参照国家标准GB/T 18932.16-2003 蜂蜜淀粉酶值的测定方法进行测定[8]。将标定的淀粉溶液加到待测样品液中，由于蜂蜜中所含的淀粉酶水解部分淀粉后剩余的淀粉与碘反应而产生蓝紫色，并随着反应的进行而逐渐消失。在660 nm 波长处以分光光度计测定其达到特定吸光度所需要的时间，以此换算出1 g 蜂蜜在1 h 内水解1%淀粉的毫升数，不同的蜂蜜样品需要做3 次平行实验。

1.3 数据处理：

数据以Excel 收集，进行简单处理后，采用SPSS19.0 软件，进行方差分析。

2 结果与分析

图1 蜂蜜样品种所含花粉的种类数量

通过镜检，供试蜂场蜂蜜中的花粉种类结果见图1，6 个蜂蜜样品中石榴蜜和野藿香蜜中所含花粉种类最少的为3 种，最多的为益母草蜜和野坝子蜜，为6 种，种类间存在差异（P＜0.01）。进一步的从上图可以看出，石榴及野藿香盛花期间，其他辅助的蜜粉源植物较少，与之相对的野坝子、益母草、苕子等花盛开时辅助的蜜粉源植物也在同一时期开花，从而增加了蜂蜜中其他植物的花粉孢子。

2.2 蜂蜜中主要花粉的花粉率

表1 6 种蜂蜜中主要花粉的花粉率

6 种已知对应蜜源植物的蜂蜜样品中主要花粉的花粉率含量均大于45%，见表1，根据Louveaux 认为某种蜂蜜中主要花粉率大于45%即可认定为某个品种的单花种蜂蜜，由此可鉴定苕子花蜂蜜、石榴花蜂蜜、鬼针草蜂蜜、益母草蜂蜜、野藿香蜂蜜、野坝子蜂蜜为对应蜜源期花种蜂蜜，即表称产品。

2.3 蜂蜜中淀粉酶活性

表2 6 种蜂蜜的淀粉酶值

6 种蜂蜜中淀粉酶值结果见表2。1～>6 号蜂蜜样品均具有淀粉酶活性，淀粉酶值差异显著，鬼针草蜂蜜最高，为34.8 mL/(g.h)、苕子花蜂蜜、益母草蜂蜜的淀粉酶值相对较高，野坝子蜂蜜的淀粉酶值最低，为9.06 mL/(g.h)，差异显著（P＜0.01）。吸光度达到0.235 时相对应的时间越短，说明蜂蜜中的淀粉酶水解淀粉的时间越快，同时也说明蜂蜜中的淀粉酶活性越强。因此，鬼针草蜂蜜、苕子花蜂蜜、益母草蜂蜜的淀粉酶活性最强，野坝子蜂蜜的淀粉酶活性最弱。

3 结论与讨论

蜂蜜的理化属性取决于蜜粉源的种类及地理环境的相互作用。蜂蜜孢粉学是确定蜂蜜物理属性的重要指标，可以确定蜂蜜的品种、质量及蜜源地的植物种类、开花季节等信息，同时也在蜂蜜产品的掺假检验中逐渐受到重视[9]。在本次研究中，我们以蜂蜜孢粉学检测手段确认了草坝镇的六种蜂蜜中花粉孢子的种类（图1），发现不同花期中蜂蜜所含的花粉孢子种类不一样，明确了不同花期中显花的植物种类。

蜂蜜孢粉学方法可以有效鉴别蜂蜜是否为表称产品，以确定某一地区中蜜粉源植物的丰富程度。陈顺安[10]（2011） 研究云南武定野坝子蜂蜜孢粉学分析，明确了当地野坝子蜂蜜纯度较高。桑丽琴[11]等（2021） 以电镜扫描中蜂蜜花粉孢子的结构，探索了秦岭中华蜜蜂的蜜源木本植物种类。在本文研究的6 种蜂蜜样品中，1～>6 种蜂蜜均采自不同的蜜源植物，对其进行主要花粉率检测，其值均大于45%（表1），可以判定其为某个品种的单花种蜂蜜，与根据采集的蜜源植物名称对其命名相符。在光镜下各种孢粉具有比较鲜明的区分特征，所有蜂蜜中除含有本种花粉外，还含有比例不等的其他多种孢粉(杂质孢粉)，不同蜂蜜含有的杂质花粉的比例也不相同。孢粉的特征和比例可以作为判定蜂产品品质的辅助依据，但部分蜂蜜在判断产地方面比较困难[12]。

淀粉酶是蜂蜜中较为重要的一种酶，蜂蜜中酶值的高低在鉴定蜂蜜的品质[13]、成熟与否[14]、东西方蜜蜂[15]、大蜜蜂与黑色大蜜蜂[16]、黑小蜜蜂蜜种[17]分辨中均有较好的运用。从表2 可知，鬼针草蜂蜜的淀粉酶值为34.8 mL/(g.h)，显著高于野坝子（9.06 mL/(g.h)） 蜂蜜，可为进一步开发鬼针草类蜂蜜奠定基础。