SOAT1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

陈瑶，杨训俊，陈涵斌，陈国荣

1.温州医科大学，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015；3.温州医科大学附属第二医院 临床检验中心，浙江 温州 325027

肝癌是所有癌症中病死率排第二的恶性肿瘤，占全世界癌症发生率的6%，在肝癌中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占85%～90%[1-2]。 肝癌的全球分布不均匀，由于HBV和HCV的高流行，超过50%的HCC病例发生在撒哈拉以南非洲和东亚，美国和北欧是HCC发病率较低的地区，但近年来有所上升[3]。肝癌的危险因素主要包括肝炎病毒感染、黄曲霉毒素暴露、酗酒和非酒精性脂肪肝。在这些因素中，非酒精性脂肪肝被认为是肝癌发病率逐年增加的关键因素之一，这也让越来越多的研究者关注脂质代谢的稳态在肝病甚至HCC发生发展中的关键作用[4]。

甾醇O-酰基转移酶（sterol O-acyltransferase， SOAT）是一种位于内质网的蛋白，可将胆固醇转化为胆固醇酯，已被认为是脂质稳态的重要因素，SOAT参与胆固醇酯的储存、胆固醇的自由吸收、脂蛋白的合成[5-6]。SOAT包含SOAT1和SOAT2两种酶，但是这两种酶之间的差异仍然存在争议。部分研究表明，在成年肝脏中，SOAT1是主要的酶，其表达水平高于SOAT2，并且在胆固醇稳态中起着更重要的作用[7-8]。有研究通过蛋白质组学的方法，鉴定出SOAT1在肝癌的早期发生和转移中发挥了关键作 用[9]。事实证明，SOAT1不仅是体内胆固醇稳态的重要酶，同时在肝癌发生发展中具有重要作用，具备成为肝癌早期诊断和治疗的分子标志物的潜力。

在我国HBV相关性肝癌占绝大部分，但目前关于SOAT1蛋白在HBV相关性肝癌中的表达和临床相关性报道却很少。本研究通过对TCGA数据库中关于SOAT1在肿瘤中的转录数据进行初步分析，探讨SOAT1 mRNA水平与肿瘤的关系及对预后的影响。同时，通过免疫组织化学方法检测SOAT1蛋白质水平在乙肝相关性肝癌中的表达情况，初步探讨其临床病理意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2018年5月至2019年10月期间在温州医科大学附属第一医院病理科诊断为HCC的患者53例，获取患者癌及癌旁石蜡组织，追踪记录所有患者详细临床资料及实验室检查结果。纳入标准：①病理确诊为HCC；②手术前未接受化疗或放射治疗；③有详细住院资料；④有HCV感染史或表面抗原检测阳性；⑤自愿参与本次研究的温州人或在温州生活5年以上。排除标准：①有基础代谢 性、感染性疾病；②有其他肿瘤病史；③曾接受过放化疗；④无法获取完整临床资料；⑤非温州地区人群。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有受检者知情同意。

1.2 实验材料 SOAT1多克隆抗体购自美国Abcam公司（ab39327），PV-8000通用型免疫组织化学二抗试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。每个标本收集癌组织和对应癌旁组 织，连续切片，厚度为4 μm，置于防脱落载玻片上，烘干后于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 实验方法 上述白切片经常规烤片、脱蜡和水化后，0.3% H2O2避光孵育10 min以修复抗原，PBS冲洗3遍，每遍5 min；高压抗原修复10 min，自然冷却至室温，PBS冲洗3遍，每遍5 min；滴加SOAT1 抗体（1:400稀释），4 ℃孵育过夜。次日37 ℃复温30 min，PBS冲洗滴加二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗3遍，每遍5 min；在每张切片上滴加100 mL现配DAB显色剂，室温下避光显色，3～5 min后蒸馏水冲洗终止显色。苏木精对比染色1 min，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察切片，进行评估。

1.4 结果判定 所有结果均由2位病理医师独立进行评估，以保证结果的可重复性。SOAT1为细胞浆着色，评分采用着色深浅和阳性细胞比例相结合的方法，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度分数和阳性细胞百分比分数相乘得到染色分数。具体评分标准如下：＜7分为低表达组，≥7分为高表达组[10]。

1.5 生物信息学分析 收集TCGA数据库374例HCC组织及50例正常对照肝组织的RNA-seq数据，比较两种组织中SOAT1表达量的差别。同时，根据RNAseq数据，以表达量的中位数为界将肝细胞癌分为高表达与低表达2组，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，总生存时间从疾病诊断开始计算至患者死亡。

1.6 统计学处理方法 采用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用±s表示，2组间比较用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，2组间比较采用秩和检验；计数资料用率表示，2组间比较用χ2检验；相关性分析采用Spearman等级相关；采用Kaplan-Meier法与Log-Rank检验进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据结果 通过Starbase3.0数据库，获取并分析来源TCGA数据库中的374例HCC癌组织和50例正常对照肝组织。比较2组中SOAT1 mRNA的表达量，结果显示SOAT1 mRNA在癌组织中表达水平显著高于正常肝组织（P＜0.01）；生存曲线结果显示低表组5年生存率更高（P＜0.05），但10年生存率两者差异无统计学意义（P=0.140），见图1。

图1 TCGA数据库中SOAT1表达量及生存曲线分析

2.2 SOAT1在HCC组织和癌旁正常组织中的表达 免疫组织化学采用人工半定量分析法，结果显示肝癌组织中SOAT1有22例高表达，31例低表达；而在癌旁正常肝组织中有8 例高表达，30 例低表达，差异有统计学意义（P=0.041）。SOAT1在癌组织中的蛋白表达量也显著高于癌旁正常肝组织（6.415± 3.433 vs. 4.413±2.341，P＜0.01），见图2。

图2 SOAT1在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况

2.3 HCC组织中SOAT1蛋白表达量与临床病理相关性 结果显示SOAT1表达水平与肝癌临床分期呈正相关（r=0.320，P=0.021），并且发现SOAT1高表达组中更易见微血管癌栓（P=0.013），表明SOAT1与肿瘤血管侵袭相关。但该蛋白表达与年龄、性别、BMI、肿瘤大小、肿瘤分化程度、肝功能和血脂含量等指标无明显相关性。具体见表1。

3 讨论

肝癌为发病率和病死率都极高的恶性肿瘤。近年来从发病危险因素分析到早期诊断、疗效监测和预后评估的分子标志物的寻找，再到放化疗耐药机制的探讨，以及靶向药物的研发都在世界各中心和研究所中进行相应的研究，并且取得了一些可观的进展[11-13]。肝癌的早期诊断敏感性和特异性有所提高，治疗的5年生存率也有一定程度的提高，但仍然只有17%左右。

HCC作为肝癌中最主要的类型，是肝癌研究的重点。HCC的发生发展主要由复杂的遗传因素[14-15]（遗传风险因素、基因变异等）和环境因素[16-17]协同作用，共同促进肝炎-肝硬化-肝癌的转变效应。当前晚期肝癌的治疗手段有限，效果不佳，且花费巨大，因此寻找早期诊断或与肝癌发生发展相关的分子标志物，是有效改善肝癌患者诊疗的途径，也是当前研究肝癌的重点方向。

表1 SOAT1不同表达量与临床病理指标相关性分析

国家蛋白质科学中心通过蛋白质组学的方法，鉴定出了在HCC早期发生中发挥关键作用的蛋白SOAT1，并通过实验证实该蛋白可以促进肝癌细胞的增殖和迁移[9]。SOAT1在将内质网胆固醇转化为胆固醇酯并将其储存在脂滴中的过程中发挥了一定作用，是血管粥样硬化和冠心病的危险因素[18-20]。 此前已有研究报道该蛋白在恶性胶质瘤、前列腺癌和乳腺癌的发生发展中发挥一定作用，具有作为多种癌症治疗靶点的潜力[21-24]。本研究通过生物信息学方法，利用TCGA数据库数据证实HCC组织中SOAT1 在转录水平上同样表现出显著增强，并且发现SOAT1 高表达的患者预后比低表达的患者差。mRNA水平的结果证实了SOAT1在HCC发生发展中具有一定作用，这与前期蛋白质组学的研究结果相符。此外，本研究通过免疫组织化学的方法，检测HCC组织和配对癌旁组织中SOAT1的蛋白质含量，发现SOAT1在肝癌组织中表达量显著高于癌旁组织，这结果与蛋白质组学发现的现象相一致。通过比较SOAT1表达量不同的HCC患者资料，发现该蛋白高表达患者TNM临床分期更偏中晚期，且更易见与肿瘤细胞转移相关的微血管癌栓。我们推测SOAT1在肿瘤发展过程中具有累积效应，说明可能在HCC发展过程中发挥一定作用，而更易见微血管癌栓则能说明SOTA1可能参与肿瘤的侵袭和转移[25]。基于以上发现，我们推测SOAT1通过促进胆固醇脂的合成，进而增加了细胞膜上与癌细胞生长和迁移相关的胆固醇脂类受体，从而在促进癌症的发展和转移中发挥作用。此外，SOAT1表达量与肿瘤大小和肿瘤分化程度无关，且不影响肝功能、AFP、血脂等指标。提示SOAT1在HCC中的作用可能较为局限，值得进一步多中心、大样本量进行验证。

综上所述，本研究证实SOAT1在HCC中表达显著增加，并且发现SOAT1高表达与肿瘤恶性程度、转移倾向相关，表明其可能作为判断HCC患者病情进展及预后的依据之一，有望成为肝癌诊断、预后及疗效判断的分子标志物。但是本研究还存在不足之 处，其一，本次纳入的样本量较少，需要扩大样本量进行验证；其二，未收集正常患者肝组织标本，无法证实肝癌患者正常肝组织是否已经发生SOAT1表达量增高的情况；其三，本研究主要通过临床数据揭示SOAT1与肝癌发生发展的相关性，并未涉及具体功能机制，这值得进一步深入研究。