CDC45在肝细胞癌组织中的表达及其与预后的相关性

高原 徐新生，2 张晖

1天津市南开医院肝胆胰外科 300102；2天津医科大学肿瘤医院 300060

0 引 言

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的癌症之一，且其发病率和死亡率位居所有癌症前列[1-3]。目前，中国的HCC 患者占全球HCC 患者的50%以上[4]。美国癌症协会的统计数据显示，HCC的发病率与死率仍在持续增长[5-6]。目前，HCC 的早期诊断方法主要有甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）检测和B 超检测。AFP 一直被视为HCC 的肿瘤标志物，但由于AFP 的敏感性和特异性低，目前超声检测仍然是临床上唯一推荐的HCC 筛查方法[7]。然而，由于早期HCC 症状不明显，多数HCC 在诊断时已处于晚期，此时患者的五年生存率极低[8]。因此，临床上迫切需要一种对HCC 灵敏的新型生物标志物，以便对HCC 进行早期诊断、治疗，从而改善患者的预后。

细胞分化周期蛋白45（cell division cycle 45，CDC45）是一种高度保守的多蛋白复合物，包括CDC6/CDC18、微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs)和DNA 聚合酶，对真核生物DNA 复制的早期步骤具有重要作用。有研究结果显示，CDC45 可促进细胞增殖，与原代人类细胞相比，人类癌症衍生细胞中的CDC45 水平始终较高[9]。c-Myc 是公认具有致癌活性的基因，而CDC45的高表达概括了所有c-Myc 诱导的复制和损伤表型[10]。大量的研究结果表明，CDC45 与多种肿瘤的发生发展密切相关，且在多种肿瘤组织中高表达，如宫颈癌[11]、甲状腺乳头状癌[12]、非小细胞肺癌[13]等。近年来的一些研究结果表明，CDC45 在食管癌[14]、结直肠癌中也高表达并与疾病进展和预后相关[15]。上述研究结果均表明，CDC45 在多种肿瘤中高度表达，并且与肿瘤疾病发展紧密相关，有成为肿瘤生物标志物和治疗靶点的潜力。但关于CDC45 与HCC 之间的关系，国内外还鲜有报道，有待进一步去探索。

本研究中，探究CDC45 在HCC 组织与癌旁正常组织中表达量的差异并分析与临床病理特征之间的关系。本研究结果有助于更深入地探究CDC45在HCC 中的作用机制，可以为HCC 的早期诊断、检测及疾病进展期治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013 年3 月至2021 年3 月，天津市南开医院和天津医科大学肿瘤医院收治的经手术治疗的HCC 患者90 例。其中，男性50 例，女性40 例，年龄（53.2±6.78）岁。全部病例均经过临床病理证实，并具有完整的病例资料。收集患者的HCC 组织与癌旁正常组织的石蜡标本，并收集患者的相关临床资料，包括年龄、性别、肿瘤结节数、肿瘤大小及AFP表达水平。本回顾性研究中，对所有标本的研究属于对手术石蜡标本的二次利用。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与仪器

Anti-CDC45 抗体（ab230178，英国Abcom 公司)，3,3’-二氨基联苯胺（DAB）（美国Cell Signaling Technology 公司）。RM2235 型石蜡切片机（德国Leica 公司），BX51 型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2.2 免疫组织化学检测

将石蜡标本在5 ℃下切片，在65 ℃下烘烤45 min进行脱蜡。切片在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中清洗3 次，每次3 min。将切片放入枸橼酸缓冲液，将抗原放入微波炉高火处理5 min，中火处理10 min。去除多余的水，将H2O2溶液滴在湿盒子中15 min，再用PBS 清洗3 次，每次2 min。切片用体积分数为4%的多聚甲醛溶液固定25 min，然后用体积分数为2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在PBS 中室温封闭20 min，切片用anti-CDC45 抗体在4 ℃下孵育过夜。将切片在结合辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）的生物素二抗中孵育15 min 后，用DAB 试剂盒进行染色反应。最后用中性树胶封片，倒置显微镜下观察。

显微镜观察时，随机选取5 个不同的视野，依照阳性细胞比例和阳性染色强度2 个指标评定组织切片中CDC45 的染色水平。阳性细胞比例评分标准：肿瘤细胞阳性百分数为0%时，记为0 分，1%～25%时，记1 分，26%～50%时，记2 分，51%～85%时，记3 分。阳性染色强度评分标准：无染色记0 分；弱染色记1 分；中度染色记2 分；高度染色记3 分。以阳性细胞百分比评分和染色强度评分的乘积判断表达情况，其中结果为5～9 分为高表达组，结果为1～4 分为低表达组。

1.2.3 临床样本生物信息学分析

通过基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CDC45）和癌症基因组图集（the cancer genome atlas，TCGA）数据库进行生物信息学分析。筛选阈值为P＜0.05 和，其中FC（fold change）表示两组间表达量的比值。同时以中位数作为Kaplan-Meier 生存分析的基础，用虚线标记95%置信区间。在线分析CDC45 在HCC 组织与癌旁正常组织中的表达量。此外，分析CDC45 高低表达与HCC 患者的总生存率、无病生存率的关系。

1.3 统计学方法

采用Graphpad8.0 统计学软件处理数据。定量数据采用均数±标准差（Mean±SD）表示。比较临床病理特征与CDC45 表达间的关系时，采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CDC45 在HCC 组织中的表达及与预后的关系

通过GPEIA 在线分析CDC45 在HCC 组织和癌旁正常组织中的表达情况，共分析HCC 组织369例及癌旁正常组织160 例。结果表明，CDC45 在HCC 组织中显著高表达（P＜0.05）（图1）。为了进一步证明CDC45 在HCC 进展演变中发挥的作用，利用Kaplan-Meier 分析CDC45 与HCC 患者预后之间的关系。结果表明，CDC45 表达量较高的患者中，总生存率（P＜0.001）和无病生存率（P＜0.001）均较低（图2A 和2B）。上述结果提示，CDC45 在HCC 组织中的表达水平偏高，并与HCC 患者的预后生存期相关。

图1 肝细胞癌（HCC）中细胞分化周期蛋白45（CDC45）的mRNA 表达情况

图2 细胞分化周期蛋白45（CDC45）表达与肝细胞癌患者生存率的相关性

2.2 CDC45 在各种肿瘤组织中的表达

生物信息学分析结果显示，CDC45 在甲状腺癌、类癌、前列腺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌等肿瘤组织中高度表达，而在胰腺癌、卵巢癌中表达却并不明显（图3）。因此，进一步探究了CDC45 在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌中的表达情况。结果表明，CDC45 在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌组织中免疫组化染色呈阳性（图4）。

图3 细胞分化周期蛋白45（CDC45）在部分肿瘤中的表达情况

图4 细胞分化周期蛋白45（CDC45）在几种常见肿瘤中的免疫组化染色结果（×200）

2.3 CDC45 作为HCC 潜在生物标志物分析

上述结果提示，CDC45 可能是HCC 的一种潜在预后相关生物标志物。因此，对CDC45 作为肺癌与胰腺癌的预后标志物，进行了可行性分析。结果表明，CDC45 在2 种肿瘤中均可发挥显著的预后生物标志物作用，且在胰腺癌中更加明显（图5）。该结果提示，CDC45 有望在HCC 的预后预测中发挥作用，并有望成为靶向治疗的靶点。

图5 细胞分化周期蛋白45（CDC45）作为肿瘤不良预后标志物的潜力

2.4 CDC45 在HCC 组织中的表达

为了探究CDC45 在HCC 的进展中的作用。本研究中，运用免疫组织化学染色方法检测90 例胰腺癌组织中的CDC45 的表达情况。结果显示，CDC45 主要表达在细胞核。根据染色强度，将患者分为CDC45 高表达组和CDC45 低表达组(图6A)。分组后发现，CDC45 在癌旁正常组织中的表达量显著降低（图6B）。上述结果提示，CDC45 在HCC 的疾病进展中发挥着重要作用。

图6 肝细胞癌组织和癌旁正常组织中细胞分化周期蛋白45（CDC45）的免疫组化结果

2.5 CDC45 表达水平与HCC 患者的临床病理特征的相关性

为了阐明CDC45 在HCC 进展中的作用，分析比较了CDC45 高表达组和CDC45 低表达组患者的临床病理特征差异，包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤结节数和AFP 水平。分析结果表明，CDC45 高低表达与HCC 患者的肿瘤结节数（P=0.003）和肿瘤大小（P=0.003）的相关性有统计学意义，而与年龄、性别、AFP 水平的相关性无统计学意义（均P＞0.05）。（表1）

表1 细胞分化周期蛋白45（CDC45）蛋白表达与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性分析

3 讨论与结论

HCC 是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的第二大主要原因[16]。超声作为一项有效的早期筛查技术，对HCC 有着较高的检出率。但AFP 作为HCC 的生物标志物，其特异性和敏感性低，对于体积较小的肿瘤或极早期的HCC，仍然效果不佳。近年来的大量研究结果表明，CDC45在多种肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色，如食管癌、宫颈癌、甲状腺乳头状癌、非小细胞肺癌等，尤其在直肠癌中更加明显。本研究结果与上述结果一致。本研究中，利用GEPIA 数据库发现了CDC45在甲状腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、类癌、尿路上皮癌中高度表达。此外，通过GEPIA 数据库在线分析了CDC45 的mRNA 在HCC 组织与癌旁正常组织中的表达情况，发现HCC 组织中CDC45 的mRNA表达明显高于癌旁正常组织。进一步，分析了CDC45 表达量与HCC 患者预后的关系。结果显示CDC45 表达量越高，HCC 患者的预后情况越差。为探明其中的原因，本研究中搜集了90 例HCC 患者的HCC 组织并对其进行了免疫组化染色。结果显示，HCC 组织中的CDC45 表达量明显高于癌旁正常组织，进一步验证了之前的结论。Pollok 等[9]的研究结果表明，人类癌症衍生细胞中的CDC45 水平始终较高，CDC45 的表达与增殖细胞群紧密相关，促进癌细胞生长。因此推测CDC45 与HCC 肿瘤的大小、癌结节数有关。本研究中，通过分析CDC45 表达水平与HCC 患者的临床病理特征的相关性，发现CDC45 表达水平与HCC 肿瘤大小、癌结节数的相关性均有统计学意义（均P＜0.05），而与患者年龄、性别、AFP 水平的相关性无统计学意义（均P＞0.05）。

关于CDC45 在一些肿瘤中的具体作用机制及信号通路，有研究者已经通过研究进行了揭示。Yang 等[17]报道了热休克蛋白家族成员DNAJA1 被E2F 转录因子1 激活，然后通过稳定CDC45 来促进细胞周期，进而通过这个途径促进结直肠癌的发展，且与浆膜浸润、淋巴结转移正相关。Ke 等[14]的研究结果表明RING1 和YY1 结合蛋白（RYBP）通过下调CDC6 和CDC45 抑制食管鳞状细胞癌增殖。但关于CDC45 在HCC 中的作用机制仍未见报道，这是需要进一步探究的方向。

本研究通过生物信息学、免疫组化分析等手段初步阐释了CDC45 表达与HCC 进展及预后之间的关系，为进一步探究CDC45 对HCC 的作用机制提供了基础依据，也为HCC 的早期诊断、检测以及疾病进展期治疗提供了新的思路。本组研究存在样本量小的不足，所得结果可能存在误差，下一步将通过构建小鼠模型结合细胞培养，进一步探究CDC45对HCC 的作用机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突