昆虫肠道菌群的功能及检测方法研究进展

吕文祥，刘丽娟，公茂庆

山东省寄生虫病防治研究所，山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 济宁 272033

昆虫肠道菌群是昆虫消化道内所有细菌群落的统称，一般可分为有益菌、有害菌和中性菌[1-2]。以往研究发现，昆虫特殊的肠道结构丰富了肠道菌群的多样性，同一昆虫不同肠道部位、同一昆虫在不同发育阶段的肠道菌群都有所不同[3-7]，不同种类昆虫的肠道优势菌群也不同[4,8]，且受饮食[9-11]、发育阶段[7,12]、温度[13-14]等多种因素的影响。昆虫携带多种肠道微生物群落，这些微生物在宿主的营养代谢、消化吸收、免疫防御以及提高宿主抗药性方面发挥着重要作用[15-16]；同时肠道微生物稳态的维持有利于宿主昆虫的正常生理活动和各项生命活动的进行[17]。传统的培养法在昆虫肠道菌群的研究中存在诸多弊端，阻碍了肠道菌群的深入研究[18]。近年来，随着分子生物学、宏基因组学、生物信息学等新技术的发展和应用，昆虫肠道菌群的研究成了热点。本文对昆虫肠道菌群对宿主的作用以及检测方法的研究进展进行以下综述。

1 昆虫肠道菌群对宿主的作用

1.1营养代谢 昆虫肠道菌群的主要作用是营养代谢，其次是消化和解毒[19]。肠道菌群参与宿主营养代谢的一个重要方式是协助消化食物[20]。常见的昆虫如蝗虫、蜜蜂、蚊虫等，其肠道菌群可分泌多种消化酶。蝗虫肠道菌群具有较高的肠道纤维素分解活性，并含有多种能够分泌纤维素酶的微生物[21];蜜蜂从花粉和花蜜中获得碳水化合物、氨基酸和糖类物质，肠道微生物的酶可以促进这些营养物质的降解和发酵，生成短链脂肪酸以供宿主利用[22-23]；在蚊虫中，雌蚊和雄蚊摄食植物花蜜后，一部分被直接消化吸收，另一部分被输送到肠道，在肠道菌群的作用下，转化为宿主和肠道微生物共同的能量来源[24]。雌蚊肠道菌群还参与了血液的消化和吸收，为宿主提供发育和孵化所需的铁和蛋白质[25]。

肠道菌群还能通过参与宿主营养代谢影响宿主的摄食行为，有文献报道果蝇肠道内的细菌可以改变果蝇对营养刺激的固有化学感觉反应。研究者将果蝇卵分别接种醋酸杆菌和乳酸杆菌两种菌群，接种醋酸杆菌的果蝇高度反感富含蛋白质的食物，而接种乳酸杆菌的果蝇更倾向于富含碳水化合物的食物[26]。这些细菌引起宿主行为的变化可能反映了肠道菌群的代谢需求，并通过促进肠道中氨基酸的合成来补充宿主的营养[27]。

1.2免疫防御 昆虫在生长发育的各阶段都有可能受到细菌、病毒、寄生虫等病原体的威胁，昆虫的肠道上皮细胞可以产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)来保护宿主免受病原微生物的侵害[28]。近年来研究表明，寄生在肠道内的共栖微生物是宿主免疫的重要参与者。有研究发现大蜡蛾幼虫中肠的主要细菌群是肠球菌，肠球菌数量的增加与免疫相关基因表达水平的升高成正相关[29]；另有研究发现传统饲养的红棕象甲幼虫具有较高的酚氧化酶活性和较强的抗菌活性，剥离肠道细菌后红棕象甲幼虫的免疫能力和存活率均显著下降，而其与肠道微生物群重新结合则可以通过提高其免疫能力从而使其存活率上升[30]，上述研究证实了肠道共生菌对宿主有免疫刺激作用。肠道菌群对维护昆虫免疫系统的健康是必不可少的，同时利用肠道细菌影响昆虫的免疫能力也为治理害虫提供了新的策略。

1.3增强宿主抗药性 化学杀虫剂广泛应用于农林业害虫的防治，促进了世界农业和经济的发展。与此同时，杀虫剂的过量和不规范使用导致害虫抗药性的产生。昆虫抗药性的机制多为降解酶上调、药物作用靶位改变、药物排泄增加等，而这些机制通常归因于昆虫基因组的进化[31]，但越来越多的证据表明宿主肠道微生物对杀虫剂的代谢可能是影响抗药性强弱的原因之一。研究发现，肠道菌群可以影响昆虫杀虫剂抗性表型的表达[32]，同时有些细菌可直接降解有机杀虫剂。Chen等[33]采用不同类型的抗生素改变家蚕的肠道菌群，发现经多黏菌素B处理的家蚕对有机磷杀虫剂毒死蜱更敏感，研究表明肠道菌群对宿主抗药性具有重要影响，特定种类的细菌可以保护宿主幼虫免受杀虫剂的毒害。Dada等[34]发现杀虫剂的种类和暴露时间不同，成蚊肠道微生物的多样性也会产生明显差异，这表明如果持续接触杀虫剂可能会选择杀虫剂代谢细菌，这也可能是宿主对杀虫剂抵抗力不同的原因。

1.4菌群失调对宿主的危害 菌群失调是指肠道正常菌群的各个菌种之间的比例发生的改变较大，远远超出了正常范围，使宿主处于不利状态。有研究表明，真菌感染会显著增加蚊虫肠道细菌的负荷量，减少肠道细菌的多样性，最终导致蚊虫肠道细菌紊乱，加速了蚊虫的死亡[35]。蜜蜂在采蜜过程中经常遇到有机磷除草剂草甘膦，这种除草剂会影响微生物的生长，导致蜜蜂肠道菌群失调从而降低对病原体的敏感性[36]。此外，抗生素常用于预防幼蜂的细菌感染，但长期使用抗生素也会引发肠道微生物的失调，增加机会性病原体的易感性而危及蜜蜂的健康[37]。

2 昆虫肠道菌群的检测方法

2.1传统培养法 传统培养法是利用鉴定性或选择性培养基对昆虫的肠道菌群进行分离纯化培养，结合细菌个体、菌落以及次生代谢产物的形态学、生理学、生态和生化学特征等进行种类鉴定[8,18]。分离培养法是细菌学研究中最基本的方法，是观察细菌生长繁殖特点和获得纯培养物的必要手段[38]，该法检测成本低，设备要求不高[39]。但传统的培养法受到很多条件的限制，许多肠道细菌无法通过培养获得，不能系统揭示昆虫肠道菌群的特征。

2.2分子生物学技术 分子生物学是通过研究生物大分子(核酸、蛋白质等)的结构和功能从而阐明生命现象本质的学科。分子生物学技术将遗传性疾病和病原体的检测、诊断、治疗等方面的研究提高到了基因分子水平，极大地缩短了实验周期，降低了实验成本[40-41]。分子生物学的发展为昆虫肠道细菌的研究提供了强有力的技术平台，人们对昆虫肠道细菌的研究逐渐深入到微观水平，由细菌群落到细菌个体，再到细菌核酸和蛋白质的分子水平。

2.2.1DNA提取 DNA提取是昆虫肠道菌群研究的常规步骤，是分子生物学技术的前提[42]。DNA提取通常是从昆虫的肠道菌群中释放DNA，抑制核酸酶，去除蛋白质、无机盐等物质。DNA提取方法通常有十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)、酚抽提法、盐析法、十二烷基硫酸钠法(SDS)、醋酸钾法、商业试剂盒等[43]。不同种类的昆虫其肠道菌群存在差异，应选择合适的DNA提取方法，CTAB法和SDS法是提取各种生物DNA的常用方法[44]，这些方法价格相对便宜，但操作繁琐比较费时。目前，方便、快捷的商业试剂盒更易于接受，受到广泛关注。

2.2.2变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) DGGE是利用碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变形度的区别，将野生型和突变型DNA片段分离的技术，现已广泛应用于昆虫肠道细菌群落的多样性分析。Zhang等[45]利用DGGE技术对草蠹蛾幼虫肠道细菌多样性进行研究，发现其中肠的细菌群落在不同的地区变化很大，并且受到饲喂条件的影响，后肠的细菌群落更具多样性且比较稳定，受外界环境影响较小。Milanovi等[46]对来自比利时、荷兰和泰国的食用性粉虫和蚱蜢进行PCR-DGGE分析，结果显示比利时粉虫和荷兰蚱蜢的优势菌种为葡萄球菌属，而泰国粉虫和蚱蜢的优势菌种为芽孢杆菌属。Bigiotti等[47]利用PCR-DGGE技术证明了在共同饲养的情况下，野外果蝇体内的共生菌可水平转移到实验室果蝇体内。DGGE虽然使用起来简单快速，但它也存在一些局限性，如要求DNA片段大小在100～500 bp，并且只能反映优势菌群。

2.2.3蛋白质组学 蛋白质组学是对细胞、组织或生物体的蛋白质组进行研究，包括蛋白质在任何阶段的表达、结构、功能、相互作用和修饰等[48]。通过蛋白质组学检测肠道菌群的蛋白质组成和差异表达，可进一步推测肠道菌群的作用。Colvin等[49]利用差异蛋白质组学对从致倦库蚊死亡幼虫中肠分离的耐久肠球菌进行研究，结果表明这种肠球菌对致倦库蚊幼虫具有显著的毒性。在过去的几年里，蛋白质组学的各项技术已经在各类真核生物和原核生物蛋白质的纯化、分析、表征、定量、序列和结构分析以及生物信息学分析方面取得了成功。但是，蛋白质组学对技术人员、设备软件和数据库的要求较高，大大增加了使用成本，这也限制了蛋白质组学的广泛使用[50]。

2.3宏基因组学 宏基因组学又称元基因组学或微生物环境基因组学，通过提取昆虫肠道全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，分析昆虫肠道菌群的遗传组成和功能。基于测序技术的宏基因组学分析速度快、应用范围广、克服了部分微生物难以甚至不能用传统分离法在实验室条件下培养的局限性、揭示新的基因和微生物途径，使我们更全面地了解微生物群落的结构和功能[51-53]。

高通量测序技术，又称“下一代”测序技术[54-55]，可对几十万到几百万条DNA分子同时进行测序。经过数年的开发与改进，高通量测序技术已由一代测序技术发展到三代测序技术，一代测序技术又称Sanger测序，由于成本高、耗时长、通量低等缺点现在通常不再使用，现在广泛使用的是二代测序技术和三代测序技术。常见的二代测序技术有Illumina公司的Solexa、Hiseq技术，Roche公司的454技术和ABI公司的SOLiD技术。三代测序[56]通常指单分子测序技术，三代测序具有运行速度快、不需要模板扩增、可以直接检测表观修饰位点等特点，它弥补了二代测序读长较短、易受GC含量影响等缺点，已在小型基因组从头测序和组装中有较多应用。目前，在昆虫肠道菌群研究中应用较为广泛的是以二代测序为基础的16S rDNA测序技术。Fu等[57]采用16S rDNA测序法对崇明线虫的幼体肠道细菌进行分类，结果表明苍白杆菌属数量最多，其次为芽孢杆菌属。Razia[58]等用16S rDNA测序技术从被侵染的昆虫尸体中分离鉴定了3种不同种类的昆虫病原线虫非共生细菌。但16S rDNA也有缺点，对于种间差异较小的菌种，还需要同时借助其他方法和技术进行鉴定。

2.4生物信息学 生物信息学将计算机作为工具对各种实验数据进行储存、检索和分析，涉及信息学、统计学、应用数学、计算机学等多个学科，可进行基因识别分析、基因序列比对、蛋白比对、蛋白功能注释、蛋白功能富集等。随着蛋白质组学、基因组学、转录组学等在昆虫研究中的应用和发展[59]，传统的生物学技术无法处理庞大的数据，因此生物信息学在昆虫学研究中的作用越来越重要。生物信息学的发展依赖各种数据库的构建，在昆虫肠道菌群的研究中，首先对昆虫肠道菌群的16S rRNA测序，然后选择特定的数据库进行比对，以此对菌种进行鉴定和分析。

3 总结与展望

昆虫在长期进化过程中形成了特殊的肠道结构，这为细菌的定殖提供了合适的场所。肠道菌群与宿主互利共生，在宿主的生命活动中发挥了重要作用，宿主的消化吸收、营养代谢、免疫防御等都离不开肠道菌群的作用。同时，宿主的饮食、生存环境、免疫力等也会影响肠道菌群的稳态。

过去的研究方法主要以分离培养法为主，随着如分子生物学、宏基因组学、生物信息学等一些新技术的出现，昆虫肠道菌群的研究进一步深入。此外，昆虫肠道内微生物数量庞大、种类丰富，且受多种因素的影响，而新技术本身也有一定的局限性，因此联合使用不同的方法和技术对昆虫肠道菌群进行研究将成为今后的发展趋势。尽管大部分昆虫肠道菌群的功能现在还不清楚，但相信未来会有更为先进的技术出现，更多的细菌及其功能会被研究发现，可为害虫治理提供新策略，从而减少化学杀虫剂的使用。