解淀粉芽孢杆菌ＤＦ－７液体培养基优化及其无菌发酵液稳定性研究

敖静 李杨 高晓梅 刘晓辉 孙玉禄

摘要：为确定解淀粉芽孢杆菌DF-7的最优液体培养基及其无菌发酵液的稳定性，利用单因素试验确定了培养基最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨，最优无机盐为KH2PO4;利用响应面法得到最优培养基为蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L，在最优培养条件下DF-7发酵液OD600值为2.365;DF-7无菌发酵液在40～60℃、pH值为4～8之间、紫外线照射90min及-80℃低温条件下均有较好的稳定性，说明DF-7无菌发酵液在耐低温和抗紫外线方面具有较高的研究价值。

关键词：解淀粉芽孢杆菌;液体培养基优化;响应面法;无菌发酵液;抑菌作用;稳定性

中图分类号：S182 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2021）12-0149-06

解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）是一类具有促生作用的植物根际细菌，在促进作物生长、防治病害和改良土壤等方面有着重要作用[1]。有研究表明，解淀粉芽孢杆菌具有广泛的抗菌能力，对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、橡胶树褐根病菌（Phellinusnoxius）、橡胶疫霉（Phytophthoraheveae）、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）、尖孢炭疽病菌（Colletotrichumacutatum）等多种病原真菌具有很好抑制效果，被广泛应用于农作物病害的防治[2-4]。

目前研究表明，解淀粉芽孢杆菌可通过产生脂肽类抗菌活性物质、植物生长激素和酶类等物质[5，6]抑制植物病原菌，预防植物病害。本研究中解淀粉芽孢杆菌DF-7是从辽宁省朝阳市喀左县设施温室土壤中分离所得，具有较高的抗真菌活性，本试验以尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F.oxysporumf.sp.cucumerinum）为指示菌，研究DF-7的培养条件和无菌发酵液的稳定性，为开发不同剂型的微生物菌剂和生物农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

DF-7菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），由辽宁省微生物科学研究院分离并保存。

病原菌：尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum），由辽宁省微生物科学研究院分离并保存。

LB液体培养基[7];PDA固体培养基[7];立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂型号：LDZX-75KB）;恒温摇床（上海世平实验设备有限公司型号：SPF-2008）;可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司型号：T6新悦）;高速冷冻离心机（SIGMA公司型号：3K15）;生化培养箱[中仪国科（北京）科技有限公司型号：SPX-450]。

1.2 試验方法

1.2.1 无菌发酵液制备 取一环保存于试管中的DF-7菌株接种到100mLLB液体培养基中，37℃、180r/min培养24h得到种子液。将种子液按2%的比例接种至LB液体培养基中，37℃、180r/min培养24h[8]，5000r/min离心10min，0.22μm滤膜过滤，得到无菌发酵液备用。

1.2.2 抑菌作用测定 采用牛津杯法：将1mL尖孢镰刀菌孢子混悬液（1×106个/mL）与10mL融化冷却至45℃左右的PDA培养基混合，倒入平皿中冷却，放置牛津杯，其中加入100μL无菌发酵液，（28±1）℃培养24h，以不含菌的发酵液为空白对照，观察是否有抑菌圈出现，并测量抑菌圈大小，每个处理3次重复[9]。

1.2.3 液体培养基优化单因素试验 以LB液体培养基为基础培养基，用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、柠檬酸钠、玉米粉、乳糖和麦芽糖替代LB培养基中碳源酵母膏，替代量为20g/L。用硝酸钠、酵母膏、蛋白胨、氯化铵、尿素、大豆蛋白胨和硫酸铵替代LB培养基中氮源蛋白胨，替代量为20g/L。用硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、磷酸二氢钾和氯化钙替代LB培养基中无机盐氯化钠，替代量为5g/L[10]。接种量为2%，装液量为20%，37℃、180r/min恒温摇床振荡培养24h，测OD600值[11]，每个样品重复3次。

1.2.4 响应面法优化设计 根据培养基单因素试验结果，以OD600值为响应值，选择对其影响较显著的蔗糖（A）、蛋白胨（B）和KH2PO4（C）进行响应面优化试验，设置试验为3因素3水平[12]（表1）。

1.2.5 无菌发酵液活性成分稳定性试验 热稳定性：将无菌发酵液分别置于40、60、80、100℃水浴中60min和121℃ 20min，冷却至室温[13]。

酸碱稳定性：将无菌发酵液用1mol/L的HCl和NaOH调节pH值分别为2、4、6、8、10，置于冰箱4℃保存24h后[14]，将pH值调回至6。

紫外线稳定性：将无菌发酵液敞口置于超净台紫外线灯（功率30W）下照射20、40、60、90min[15]。

反复冻融稳定性：将无菌发酵液于-20℃冷冻2h，室温融化1h，反复冻融3次;将无菌发酵液分别在-20℃和-80℃冰箱中冷冻72h后再融化1h[16]。

以上处理后的样品均用0.22μm滤膜过滤，以未作处理的无菌发酵液（pH=6.3）为对照。利用1.2.2方法观察是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈大小，每个处理3个重复。

2 结果与分析

2.1 培养基优化单因素试验

由图1可以看出，不同碳源、氮源和无机盐对DF-7的生长量影响较大。当基础培养基中的碳源被蔗糖取代时DF-7的OD600值最大，为2.077，因此选择蔗糖为碳源;当蛋白胨被其他物质取代时，DF-7的生长量明显减少，所以氮源选择蛋白胨;无机盐的选择中，KH2PO4对DF-7的生长有较明显的促进作用。因此培养基最优碳源、氮源和无机盐分别为蔗糖、蛋白胨和KH2PO4。

2.2 响应面优化结果

利用DesignExpert8设计试验，以蔗糖、蛋白胨和KH2PO4为响应变量，OD600为响应值，进行响应面设计（表2）。分析结果见表3，得到回归方程为Y=2.070+0.230A+0.100B+0.150C+0.071AB+0.170AC-0.071BC -0.190A2 -0.150B2-0.280C2。该模型P=0.0004（P<0.01），表明回归方程具有统计学意义;其中A、C、AC和A2、C2因素对DF-7的生长量影响极显著（P<0.01），B和B2因素对DF-7的生长量影响显著（P<0.05）;AB和BC因素对DF-7的生长量影响不显著（P>0.05）。

2.3 响应曲面分析及最佳条件验证

利用DesignExpert8对数据进行分析，构建响应曲面。通过曲面模型（图2）可知，当蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L時DF-7的OD600值为2.233，验证试验OD600值为2.365，说明该模型能够较好地反映实际情况。

2.4 无菌发酵液活性成分稳定性试验

由表4可以看出，随处理温度升高抑菌圈直径逐渐减小，40℃时抑菌圈直径为17.96mm，60℃时抑菌圈直径（6.35mm）明显减小，当处理温度达到80℃时，无菌发酵液未产生抑菌圈，说明温度高于80℃以后，无菌发酵液失去了抑菌活性。由图3A可以看出，pH=2时，抑菌圈直径为7.3mm，当pH在4～8之间，抑菌圈直径基本无变化，当pH =10时，抑菌圈明显变小（16.3mm），说明抑菌作用下降;随着紫外线照射时长的增加，抑菌作用有所下降，但不明显，照射90min后抑菌圈直径仍有16.47mm，说明在90min内DF-7的无菌发酵液具有较好的抗紫外线能力（图3B）;由反复冻融试验可知，3种处理方式对无菌滤液抑菌活性影响不大（图3C），说明无菌滤液在低温下具有较好的稳定性。

3 讨论与结论

本研究利用单因素试验得到解淀粉芽孢杆菌DF-7的最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨，最优无机盐为KH2PO4，通过响应面法得到最优培养基为蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L，最优培养条件下DF-7发酵液OD600值为2.365。

本研究从4个方面考察了DF-7无菌发酵液的稳定性。在温度小于80℃时，随温度增加，无菌发酵液抑菌作用下降，说明发酵液中活性成分对高温较敏感，当温度高于80℃，未出现抑菌圈，这可能是由于高温导致发酵液中的活性物质变性[17]，失去了抑菌作用。秦楠等[18]发现一株产抗菌蛋白的解淀粉芽孢杆菌，在40～80℃范围内抗菌蛋白具有较好的稳定性。发酵液对酸碱度有一定的要求，pH值在4～8范围内稳定性较好，极酸或极碱的环境下发酵液中活性成分可能变性失活[19]，导致抑菌作用明显下降。张娟等[20]研究了解淀粉芽孢杆菌活性成分中大环内酯类抗生素的化学性质，结果表明在酸或碱条件下均不稳定，容易失活。无菌发酵液对紫外线具有一定的稳定性，90min内发酵液的抑菌作用基本不变。Wang等[21]由枯草芽孢杆菌中分离到抗菌蛋白，也具有一定的抗紫外线能力。-80℃下对无菌发酵液活性影响不大，说明发酵液在低温条件下也具有较好的稳定性。以上结果说明DF-7无菌发酵液在耐低温和抗紫外线方面具有研究价值，下一步将对DF-7无菌发酵液中活性成分以及活性物质的分离进行研究。