高通量基因测序在血液肿瘤临床应用的质量管理现状及展望

吴祁生 王芳 聂代静 周晓苏 陈佳琦，刘红星，，*

血液肿瘤是发生于造血或淋巴组织的具有高度异质性的疾病，其临床诊疗需要结合病理、血细胞形态、免疫表型、细胞遗传、分子生物学和临床表现进综合分析。世界卫生组织（world health or-ganization，WHO）的《造血与淋巴组织肿瘤分类》［1-2］与美国国家综合癌症网络（national compre-hensive cancer network，NCCN）的血液肿瘤临床诊疗指南［3-5］都越来越多纳入了具有临床诊断分型和/或预后意义的基因变异指标，包括基因突变、融合基因及基因异常表达等。这些基因变异在血液肿瘤的诊断分型、预后分层、治疗指导、微小残留病监测和耐药突变监测等方面有重要临床应用价值［1-5］。下一代高通量基因测序（next generation se-quencing，NGS）可一次对多个肿瘤相关基因、全外显子或基因转录本进行检测，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势［6-7］。

血液肿瘤临床诊疗对NGS 的应用有着迫切的需求。相对于病理机制研究和治疗手段的巨大进步，血液肿瘤的实验室检测严重滞后，尤其是NGS的应用方面。不同于传统的分子诊断技术，血液肿瘤NGS 技术流程复杂，除核酸提取、PCR 扩增、产物分析等步骤，还有文库构建、文库富集和上机测序过程，更有测序结果的生物信息学分析［8-9］。这套复杂的系统对“人、机、料、法、环”各方面的质量管理和保证提出了更高的要求［10］。本文基于NGS 在血液肿瘤临床应用中的质量管理要素现状提出见解，并做以展望，以期为血液肿瘤NGS 临床应用的规范化起到正向作用。

1 “人”

NGS 技术操作步骤多、程序复杂，需不同岗位的专业人员分工协作，包括做“湿实验”的操作人员、“干实验”的生物信息分析人员和报告分析解读人员等。虽然不同的岗位人员需要具备不同的技术能力，但又非截然分开，需要实验室负责人统筹分配和岗位间的互相配合。国家卫健委临床检验中心2019年白血病融合基因BCR-ABL1的室间质评活动数据显示，95%的做血液肿瘤基因检测的实验室为血液科自建实验室［11］。

开展血液肿瘤NGS 检测的实验室应配备获得国家要求的相应资质的专业人员（如医师、技师和研究员等系列），实验室负责人或技术负责人应有全面的NGS 知识和质量管理能力，人员能力和数量应满足所开展检测项目的要求。目前除少数血液病专科或特色医院外，血液科自建实验室基本都存在专业人员配置和岗位资质考核等方面的欠缺。另外，国家和行业层面尚无针对血液肿瘤NGS“湿/干实验”的专业技术人员的能力评估和培训，临床实验室也欠缺相应的制度。目前血液肿瘤NGS 检测均是使用实验室自建方法（laboratory developed tests，LDTs），“湿/干实验”项目研发人员的短缺也是临床实验室常态。当前血液肿瘤NGS检测专业技术人员的培养和储备尚显薄弱，有待进一步的行业建设和发展。

2 “机”

目前国内使用的NGS 仪器主要为Illumina 测序平台、Ion Torrent 半导体测序平台和华大基因的CG 测序平台［7］。除高通量基因测序仪外，开展血液肿瘤NGS 检测的实验室还应配备满足所开展检测项目需求的其他仪器设备，如超净台、生物安全柜、纯水仪、离心机、移液器、冰箱、PCR 仪和生物分析仪等。有能力开展血液肿瘤NGS 检测的实验室，应根据所开展项目合理选择测序平台和相关辅助设备，还应考虑标本类型、标本量、项目内涵、所需测序通量、周转时间等因素。

当前临床实验室购置的高通量测序仪，大多数为尚未经国家药品监督管理局（national medical product administration，NMPA）批准的仪器，需要实验室进行确认试验，以证明可满足临床预期用途。同时，实验室应建立仪器使用、维护和校准程序，并在日常工作中例行维护和定期校准，以保证仪器设备的正常运行，仪器设备维护和校准应保存相应记录［12］。

3 “料”

不同于实体肿瘤的取材困难，血液肿瘤的标本类型有骨髓、外周血和淋巴结等，样本取材和保存相对容易，易获得高质量的核酸样本。这对开展NGS 检测是很大的优势。实验室应对样本的采集容器、采集量、保存和运输条件等进行确认，以保证样本质量、避免交叉污染。实验室应做好样本不合格率、样本容器错误率、标本类型错误率等质量指标记录［13］。只有采集到符合质量要求的样本，才能为后续的NGS“湿实验”和得到高质量的测序数据打好基础。

在血液肿瘤领域，目前国内尚无已通过NMPA 审批的成套的商品化NGS 检测试剂。如何严谨负责地研发和建立LDTs 项目，并进行性能评价（包括性能确认和验证），是开展NGS 项目的临床实验室必须解决的首要问题［14］。设计不合理或结果不可靠的LDTs 项目不仅不能发挥应有的临床价值，甚至可能造成NGS 推广应用的障碍。目前已有血液专科或特色实验室开始积极进行LDTs 的性能确认工作，这是令人欣慰的事。但是对于大多数临床实验室，建立血液肿瘤NGS-LDTs 项目的全流程工作，包括项目设计、技术路线选择和试剂性能评价等，仍然存在很大挑战。由于高建设门槛，很多医院没有能力开展NGS 检测项目，这部分检测需求被转移到有能力的第三方独立实验室。

4 “法”

开展血液肿瘤NGS 检测，临床实验室应通过试剂方法建立和性能确认的过程，建立及完善整个检测系统（包括“干/湿”实验流程），明确日常检测的质量控制标准及关键点，形成检测操作全过程的标准程序文件，并明确检测系统的性能指标和检测局限性［15-16］。血液肿瘤NGS-LDTs 项目的全流程性能评价是人、机、料、法、环等要素的全面评价，相应的指标包括精密度、准确度、分析敏感性、分析特异性和可报告范围等［17-18］。

与其他实体肿瘤相比，血液肿瘤的发生率相对较低，临床血液病实验室可能在人力、物力和财力上得到的支持有限。因此，首先需要清楚本实验室使用NGS 的临床预期用途是什么？比如融合基因筛查对白血病的诊疗、危险度分层和预后判断都有重要的意义，但用逆转录荧光PCR 进行有限数量的融合基因筛查会漏检未涵盖在检测范围内的融合基因，只能解决部分问题［19-20］。使用转录组基因测序（RNA sequencing，RNA-seq）［21］，可接近全面地分析血液肿瘤中各种可能存在的融合转录本，同时还能显示基因变异的表达量［15］。如果将RNA-seq 融合基因筛查的LDTs 应用于临床检测，就必须对该检测系统进行性能评价，用客观数据证实其可显著提高融合基因筛查的阳性率。

除了性能评价外，血液肿瘤NGS 临床检测还面临着无商品化室内质量控制品（internal quality control，IQC）和室间质量评价计划（external quali-ty assessment，EQA）的难题。临床血液病实验室需主动进行室内质量控制，以监控每一次NGS 检测结果，并且进行周期性评价，以保证检测系统的精密度。有少数临床血液病实验室参加了国家卫健委临检中心的“全国实体肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价”项目，以考核所开展的NGS 项目的结果准确性。但是，血液肿瘤与实体肿瘤的体细胞突变频率、样本类型和处理方式均有很大不同，针对实体肿瘤设计的EQA 计划并不完全适合血液肿瘤。临床实验室还可选择与已获得能力认可或使用相同测序平台的外部实验室进行NGS 项目的实验室间比对，以达到能力验证的目的。

5 “环”

开展血液肿瘤NGS 临床检测的实验室应根据拟开展的检测项目数量、所用技术流程、测序平台和标本量进行实验室环境设计。实验室应至少设置5个功能区：试剂存储和准备区、样本与文库制备区、文库扩增与检测区、上机测序区、数据分析和报告解读区［12］。对开展测序深度及检测限有很大差别的NGS 测序项目，实验室宜设置不同的样本制备和文库制备区域，以防止交叉污染发生。实验室环境需注意通风、洁净度、温湿度、震动和光照等要求，以保证仪器设备的正常运行和实验过程的稳定性。

6 小结和展望

血液肿瘤标本容易获得，进行NGS 检测有着先天的优势。自从“精准医学（precision medi-cine）”的概念提出以来，血液肿瘤的精准医学研究和临床应用也走在各种肿瘤的前列。NGS 已在血液肿瘤临床诊疗方面显示出很好的应用价值，例如：用RNA-seq 较为全面分析常见和少见型融合基因，用于血液肿瘤有明确意义的突变基因的靶向测序，用于指导个体化用药的药物基因组分析，用于血液肿瘤遗传病基因突变筛查等。

NGS 提供了分析基因变异的强大工具，但检测系统的复杂性增加了NMPA 审核的难度，限制了其落地临床检测的速度。建立和使用NGS-LDTs 是一种可行的方案，但应坚持严格的考查和准入标准，即有明确的临床预期用途，在临床应用中始终基于医学科学证据和数据支持。国内血液肿瘤和分子诊断领域的专家们已经开始商讨和制定一些NGS 在血液肿瘤应用方面规范化的专家共识或专家建议，这将有助于促进NGS 技术在临床诊疗中的规范化应用。