跑台运动对去卵巢大鼠抑郁样行为、海马炎症因子及海马CA1、CA3区nNOS表达的影响

王卓琳，崔建梅，周琛斐，刘晓慧，王 超，高 薇，苏晓云

抑郁症(Major DePressive Disorder，MDD)是世界上最常见的精神障碍类疾病。目前全球抑郁症患病人群累计超过3.5亿人，其中女性的患病率(5.1%)明显高于男性(3.6%)[1]。围绝经期抑郁症是由卵巢功能衰退、雌激素水平不稳定导致的情感障碍类疾病。Shin等[2]通过对台湾南部266名44～55岁女性调查发现，该年龄段患抑郁症概率高达31.2%。Freeman等[3]通过整理2005年以来国家卫生研究院《科学状况报告》发现，有抑郁症史女性在围绝经期间患严重抑郁症概率是绝经前女性的五倍，没有抑郁症史女性在围绝经期间患严重抑郁症概率是绝经前女性的2～4倍。由此可见，围绝经期女性是抑郁症的高发人群。目前，临床上常用雌激素替代疗法治疗抑郁症，但在治疗过程中会增加乳腺癌、子宫内膜增生等疾病患病风险[4]。此外，长期患病及高额治疗可加重家庭负担。因此，寻求一种短期、安全、高效的治疗方法显得尤为重要。近年来，人们清楚地认识到体育活动可促进身心健康、参与情感调控、缓解抑郁症状[5]。有研究证明，4周中等强度跑台运动对慢性应激大鼠抑郁行为具有一定改善[6]。Blumenthal等研究发现16周有氧运动与抗抑郁药物在减轻抑郁方面有类似效果[7]。但是运动对雌激素缺乏所导致抑郁模型相关研究较少，其潜在机制也尚不清楚。

海马体(HiPPocamPus)位于大脑丘脑和内侧颞叶之间，属于边缘系统的一部分。作为情感调控的高级中枢，其与抑郁症的关系也备受人们关注。有学者认为，中枢海马神经炎症反应过度激活，可能是抑郁症发病机制之一。Wang等[8]通过正电子发射型计算机断层显像(PET)检测发现12周慢性应激诱发产生的抑郁症存在促炎因子IL-1、IL-6的过度激活[9]。此外，在患有严重抑郁症患者血清和脑脊液中发现促炎因子(IL-1β，IL-6，IL-8，IL-12，IFN-γ，TNF-α)含量增多及抗炎因子IL-10水平下降[10]。一氧化氮(NO)是参与调控神经系统疾病(如抑郁症、精神分裂症等)的重要神经递质，而神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在调节NO的产生与释放中起着重要作用。已有研究表明，运动可以通过抑制炎症反应，调节神经递质，从而缓解抑郁症状。屈红林[11]等研究发现8周有氧运动可以拮抗抑郁小鼠海马组织炎症，促进损伤的海马组织修复，改善慢性不可预见性应激(CUMS)抑郁小鼠海马功能。此外，有学者发现4～8周中等强度跑台运动可以抑制睡眠剥夺大鼠海马炎症反应，调节海马nNOS的表达，改善抑郁样行为[12,13]。但运动是否可以通过调节海马炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)及海马nNOS释放改善围绝经期大鼠抑郁样行为尚不清楚。因此，本研究通过去卵巢术建立围绝经期抑郁模型，观察4周跑台运动后去卵巢大鼠抑郁样行为、海马炎症因子及海马CA1、CA3区nNOS水平变化并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

本研究选用SPF级雌性健康成年大鼠(三月龄)30只。起始体重为(240g～280g)，采购于山西医科大学动物饲养中心，饲养于通风良好、干净卫生、可随意获得水和食物的实验室内。实验室温度(22℃±23℃)、湿度(55%±10%)、光照与黑暗周期为12h(7：00—19：00)。适应实验室环境1周后，将以上大鼠随机分为3组，每组10只，分别为假手术组(SHAM)、去卵巢组(OVX)、去卵巢运动组(OVX+EX)。

1.2 卵巢切除模型的建立

使用戊巴比妥钠(0.5ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定四肢，剪去腹部被毛，用碘伏棉签进行擦拭消毒腹部皮肤，顺着腹白线做3cm左右的切口，在腹腔中先找到子宫，沿着输卵管定位卵巢位置(成粉红色球状，直径0.5cm左右)，结扎血管后切除双侧卵巢。手术完成后，缓慢将子宫放入腹腔，随后缝合好皮肤与组织继续回笼饲养。假手术组起始步骤与手术组相同，但手术中不切除卵巢而是切除卵巢周围一小部分脂肪。为所有大鼠均给予青霉素(20 000u/kg/d)肌肉注射，以避免感染。恢复期内每日进行阴道涂片检查。如若连续五天无动情周期证明造模成功。

1.3 中等强度跑台训练方案

适应1周环境后，OVX+EX组大鼠进行4周中等强度跑台运动，跑速为15～20 m/min的跑台上训练60min(坡度为5%)。一周运动五天(周一到周五下午3点进行)，每周六、日休息两天。实验过程中不会使用任何刺激对大鼠进行驱赶，以免产生不良应激反应。

1.4 抑郁样行为测试

1.4.1 旷场试验(Open field test，OFT)在照明强度维持恒定且安静的实验室进行操作。将每只大鼠放置在周壁为黑色(100cm×100cm×50cm)的实验箱中，试验箱的底面用黑线分成25个相等的正方形。将摄像机放于离测试设备5m的控制面板上，大鼠放入中央格，观察大鼠5 min内进入中心格次数、中心格时间百分比、跨格及直立总次数。

1.4.2 强迫游泳实验(Forced swimming Test，FST)将大鼠放在竖直的塑料圆桶中(直径20 cm、高40 cm)中，水位30 cm(防止老鼠在游泳过程中用后肢或尾巴触碰圆桶底部来支撑自己)，水温(23±2)℃。摄像机置于圆桶上方全程记录，强迫游泳6 min，记录后4 min攀爬时间以及不动的时间。测试完成后，用毛巾轻轻擦拭后吹风机吹干大鼠，继续回笼饲养。

1.5 酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

行为测试结束后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉，将大鼠断头取脑剥离海马，称重后加入0.9%的生理盐水制成10%海马组织匀浆，以4 000转/分钟速度离心15min，离心后取上清液后测试海马炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.6 免疫组织化学染色

行为测试结束后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉，开胸后使用针尖插入升主动脉，用冷生理盐水300ml迅速冲洗血管，然后输入300ml 4%多聚甲醛(0.1mol/LPBS，PH 7.4)，再输入300ml10%蔗糖PBS溶液，先快后慢，结束后即刻取脑，置于4%多聚甲醛PBS溶液中，4℃固定2h，再浸入4℃ 20%蔗糖PBS溶液(PH 7.2～7.4)保存过夜。脑组织完全沉底后，将脑冠状位连续切成30μm厚的冰冻切片，隔4张取1张，然后将切片放入0.1%Triton X-100 PBS溶液(37℃)中孵育1h，加10%的山羊血清工作液孵育封闭1h，再加入nNOS血清第一抗体(1∶100)37℃孵育1h，随后加入37℃羊抗兔IgG第二抗体孵育1h，DAB呈色30min后置入0.2%明胶溶液裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7 图像分析和统计学处理

根据脑立体定位图谱确定海马CA1、CA3区的位置，用数码显微镜以及形态学软件对nNOS阳性神经元表达进行分析，在显微镜400倍镜视野下计算出nNOS阳性神经元个数以及面积。采用SPSS17.0对数据进行分析，结果用平均值±标准差进行表示；使用单因素方差分析进行统计学分析，P<0.05表示具有显著差异。

2 结果

2.1 各组大鼠旷场实验结果

表1结果显示：与SHAM组比较，OVX组大鼠中央格次数、中央格时间百分比及总运动能力(跨格+直立次数)均显著下降(P均=0.000)，下降幅度分别为46%、45%、28%，说明大鼠活动度降低，探索能力下降，出现抑郁样表现;与OVX组比较， OVX+EX组大鼠中央格次数、中央格时间百分比及总运动能力显著增加(P=0.018、P=0.047、P=0.017)，增加幅度分别为28%、21%、55%，说明通过4周跑台运动可以提高去卵巢大鼠活动度，增强大鼠探索行为。

表1 各组大鼠旷场实验结果

2.2 各组大鼠强迫游泳实验结果

从表2可以看出，与SHAM组比较，OVX组大鼠不动时间显著增加，攀爬时间显著下降(P=0.000)，不动时间增幅为25%，攀爬时间降幅为8%；与OVX组比较，OVX+EX组大鼠不动时间显著下降(P=0.018)，攀爬时间显著上升(P=0.003)，不动时间降幅为29%，攀爬时间增幅为12%。实验结果证明，通过4周的跑台运动可以改善去卵巢大鼠绝望样抑郁行为。

表2 各组大鼠强迫游泳实验结果

2.3 各组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6以及TNF-α结果

从表3可以看出，与SHAM组相比较，OVX组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6以及TNF-α显著增加(P均=0.000)，增加的幅度分别为14%、33%、69%；与OVX组比较，OVX+EX组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α显著下降(P=0.000、P=0.030、P=0.003)下降幅度分别为18%、7%、15%。说明4周跑台运动可以抑制海马炎症反应的发生。

表3 各组大鼠海马炎症因子结果

2.4 各组大鼠海马CA1区、CA3区nNOS表达结果

从表4可以看出，与SHAM组相比较，OVX组大鼠海马CA1区nNOS免疫阳性产物的面积及阳性细胞数量、CA3区nNOS免疫阳性产物的面积及免疫阳性数量均有显著下降(P=0.000)，下降幅度分别为34%、32%、46%、40%;与OVX组比较，OVX+EX组大鼠海马CA1区nNOS免疫阳性产物的面积及阳性细胞数量、CA3区nNOS免疫阳性产物的面积及免疫阳性数量均显著增加(P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.012)，增加幅度分别为12%、17% 、16%、15% 。

表4 各组大鼠海马CA1、CA3区nNOS表达结果

3 讨论

3.1 跑台运动对去卵巢大鼠抑郁行为的影响

许多学者认为雌激素对脑部具有广泛的影响，不仅参与生理和心理过程，且对情感认知具有调控作用[14]。Lu等[15]通过悬尾实验及旷场实验研究发现，成年雌性大鼠经过双侧卵巢切除术后会出现行为绝望等抑郁样表现。Maik等[16]在临床实验中发现切除子宫女性与未切除子宫女性相比患抑郁症的机率增加78%。本研究结果表明：雌激素水平的下降与抑郁症发生具有一定的相关性。具体表现为，与SHAM组比较，OVX组大鼠在旷场实验中活动探索能力下降，强迫游泳实验中不动时间延长以及攀爬时间缩短，说明卵巢摘除大鼠自主活动和探索行为减少，出现了绝望无助等抑郁行为的核心症状，证实雌激素下降可诱导出抑郁行为，证实建模成功。许多学者研究发现体育锻炼对情绪的调控具有积极作用，刘威等[17]通过对8周中等强度跑台运动与氟西汀(抗抑郁药)干预对比发现，运动干预可以取得与氟西汀治疗相似的结果。本研究发现，与OVX组比较，OVX+EX组探索能力及自主活动能力显著提高，表明有氧运动可作为药物治疗抑郁症的良好替代手段，进一步证实了体育锻炼具有良好的抗抑郁作用。

SHAM组OVX组OVX+E组

SHAM组OVX组OVX+E组

3.2 跑台运动对去卵巢大鼠海马炎症因子的影响

越来越多的证据表明，炎症反应作为机体的防御系统与抑郁症之间具有密切联系。海马作为雌激素作用靶点，激素水平迅速下降可通过释放炎症细胞，导致神经功能紊乱，进而出现“抑郁炎症反应”[19]。TNF-α是单核-巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽促炎细胞因子，可以激活T细胞，促进IL-1、IL-6产生及分泌。近年来，实验观察及临床研究表明，促炎症细胞因子(IL-1、IL-6 、TNF-α、C-反应蛋白)可以导致内分泌功能紊乱及抑郁行为的改变[20]。郝文宇等[9，21]发现下丘脑IL-1β过度表达会引起海马神经元损伤与凋亡，导致海马功能异常，从而加重抑郁症症状及脑组织损伤。此外，Zhao等[22]也在抑郁小鼠血清及大脑相关区域(前额皮层、海马和纹状体)中发现炎症因子(TNF-α、IL-1、IL-6)表达显著增多。本研究得到相同结果。与SHAM组比较，OVX组大鼠海马中炎症细胞因子(IL-1、IL-6 、TNF-α)水平增加，证实了围绝经期抑郁大鼠存在海马炎症反应增强。有学者发现，运动锻炼后骨骼肌中IL-6浓度可以增加到100倍以上，可刺激抗炎因子(IL-10等)的产生，抑制促炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6 、IL-8)的分泌，起到间接抗炎作用。本研究结果表示，与OVX组比较，OVX+EX组大鼠海马炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平均显著下降，进一步证实运动可以抑制神经炎症反应，增强海马抗炎能力，改善OVX大鼠抑郁症状。

3.3 跑台运动对去卵巢大鼠海马CA1、CA3区nNOS表达的影响

NO作为一种新型神经递质，在中枢神经系统中分布广泛，在情感障碍、抑郁症、精神分裂症等疾病中起重要作用，而nNOS是中枢神经系统中最主要的一氧化氮合酶亚型，催化产生NO[23]。因此，在病理学研究中，调节nNOS表达水平可能是治疗情感障碍的潜在靶点。有学者研究发现，慢性应激42天后海马nNOS阳性产物的表达显著减少，脑组织损伤，并引起抑郁样相关症状[24]。本研究结果显示：与SHAM组比较，OVX组大鼠CA1、CA3区nNOS阳性细胞数量及产物减少。但有研究证明在慢性应激早期抑郁大鼠海马中发现nNOS免疫阳性细胞数量和面积均显著增加[25]。有学者认为慢性应激早期11天左右nNOS阳性反应最强，到了21天以后nNOS表达逐渐减少，但早期过量的nNOS阳性反应产生的NO细胞毒性作用而导致部分神经元的功能和形态损伤，其累积产生的却并未减少[26]。因此认为海马nNOS表达具有双重状态，与应激后时间相关，在应激早期(7～11天)海马nNOS表达增加，NO的合成能力增强，过量NO从神经调节递质转变成具有神经毒性作用导致海马神经元的凋亡；到了应激晚期(21天以后)海马神经元损伤及凋亡导致体积缩小，使海马中nNOS表达减弱、活性下降。本实验检测的是去卵巢后43天的围绝经期抑郁模型大鼠。结果显示OVX组海马体中nNOS表达显著下降，而经过4周跑台运动后海马nNOS表达增加，抑郁样行为也有明显改善。因此我们认为，抑郁行为改善可能与海马体中nNOS含量减少所导致NO神经毒性减弱有关。本实验证实4周中等强度跑台运动可以改善去卵巢大鼠抑郁样行为，可能是通过增强海马CA1、CA3区nNOS蛋白的表达及活性，增加NO释放，抑制海马体中炎症反应。因此，定期体育锻炼可作为抑郁症状缓解的非药物干预手段，但情感疾病动物模型可能不完全符合人类状况。相关机制还需进一步研究。

4 结论

(1)雌性成年健康大鼠切除卵巢后海马促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)产生增多，海马CA1、CA3区nNOS免疫阳性细胞的数量和阳性细胞面积显著下降，出现抑郁样行为。

(2)经过4周中等强度的跑台运动的干预可以改善去卵巢大鼠的抑郁样行为，增强海马炎症反应及海马CA1、CA3区nNOS免疫阳性细胞的数量及阳性细胞面积。

(3)4周跑台运动改善去卵巢大鼠抑郁样行为可能与此运动增强海马组织抗炎症能力、调节海马CA1、CA3区的nNOS表达从而对去卵巢抑郁大鼠起到脑保护作用有关。具体机制需进一步研究。