人乳头瘤病毒DNA基因分型和E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查中的临床价值

陆 璐，成 建

1江苏卫生健康职业学院生化教研室，江苏 南京 211800；2南京医科大学附属妇产医院产前诊断中心，江苏 南京 210004

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率在我国女性恶性肿瘤中位居第二。宫颈癌的发生、发展与人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染密切相关［1］。不同的HPV亚型具有不同的致病性。目前已分离出HPV 亚型120 余种，其中常见高危型有18种。临床上常用的HPV DNA 基因分型检测能反映宫颈上皮细胞的病毒种类和载量，但对病毒的活动程度无法知晓。研究发现，高危型HPV E6/E7 mRNA可反映致癌基因E6/E7的活动度，其过度表达是宫颈癌及癌前病变发生的关键［2］。本研究通过比较HPV DNA基因分型检测和HPV E6/E7 mRNA 检测结果，评估两种方法在宫颈癌早期筛查中的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 对象

选取2018年1月1日—12月31日在南京医科大学附属妇产医院妇科、宫颈科、妇女保健门诊就诊，并自愿接受宫颈部位HPV DNA 基因分型检测及HPV E6/E7 mRNA 检测的女性，年龄18～88 岁。其中，接受HPV DNA 基因分型检测的样本共29 081 例，接受E6/E7 mRNA 检测的样本共22 562例。本研究经医院伦理委员会批准，所有被检者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

标本使用专用HPV 采样刷，由门诊医生取宫颈脱落细胞储存于有专用细胞保存液的取样管中，4 ℃冰箱保存，1 周内检测。

1.2.2 HPV DNA分型检测

使用亚能生物技术（深圳）有限公司生产的人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测试剂盒及人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统，对23种HPV基因型进行检测，其中包括18 种高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV83、HPV82）和5种低危型（HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV81）。检测过程严格按照试剂盒及检测系统说明书进行，包括标本DNA 提取、聚合酶链反应（polymerase chain reac⁃tion，PCR）、导流杂交。根据芯片上HPV 基因型分布的相应位点进行判读。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测

使用美国豪洛捷公司（Hologic）研发的Aptima HPV（14种高危亚型）试剂盒、Aptima HPV 16、HPV 18/45 分型检测试剂盒及Panther一体化检测平台进行HPV E6/E7 mRNA 检测。检测过程分为两个步骤，第一步：使用Aptima HPV（14 种高危亚型）试剂盒对14 种高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68）E6/E7 mRNA 进行检测；第二步：使用Aptima HPV 16、HPV18/45 分型检测试剂盒对第一步检测结果阳性的样本进行HPV16、HPV18/45分型检测。检测操作过程严格按照试剂盒及检测系统说明书进行（该检测过程为全自动、一体化过程，仅需将检测试剂、样本放入后机器运行检测程序即可）。检测结果判读：系统自动读出“阴性、HPV 16型阳性、HPV 18/45型阳性、其他阳性”4种结果。

1.3 统计学方法

应用SPSS16.0软件进行统计分析，以百分率作为HPV 感染的统计描述。两样本间率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法检测结果分析

在接受HPV DNA 基因分型检测的29 081 例样本中，共检出阳性例数8 602 例，HPV 阳性率为29.57%（8 602/29 081），其中高危型阳性例数7 425例，高危型阳性率为25.53%，占86.32%（7 425/8 602）。检测的23 种HPV 亚型均有检出，高危型HPV 感染前5 名依次为HPV52、HPV16、HPV53、HPV58、HPV51，占阳性例数百分比分别为22.13%（1 904/8 602）、14.32%（1 232/8 602）、13.22%（1 137/8 602）、10.63%（914/8 602）、9.13%（785/8 602）。在接受E6/E7 mRNA 检测的22 562 例样本中，共检出阳性病例2 840 例，高危型阳性率为12.59%（2 840/22 562），其中HPV16 阳性患者557 例，占19.61%（557/2 840），HPV18/45 阳性患者198 例，占6.97%（198/2 840），其他类型阳性患者2 091例，占73.63%（2 091/2 840）。具体检测结果见表1。

2.2 不同年龄段高危型阳性率比较

采用HPV DNA 基因分型和E6/E7 mRNA 检测结果按不同年龄段分组，各组检测例数和高危型阳性例数详见表2。HPV DNA 基因分型检测，高危型阳性率最高峰出现在＜25 岁年龄段；HPV E6/E7 mRNA检测，高危型阳性率排名前二的分别是≥65岁年龄段、55～＜65岁年龄段。卡方检验结果显示，两种检测方法中，在不同年龄段间高危型阳性率的差异均有统计学意义（P＜0.05）；但各年龄段间两两比较，两种检测方法中，55～＜65岁年龄段与≥65岁年龄段间高危型阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两种检测方法检测结果一览表

2.3 不同年龄段两种检测方法HPV16、HPV18/45阳性率比较

不同年龄段，两种检测方法的HPV16、HPV18/45阳性例数见表3。卡方检验结果显示，除55～＜65岁年龄段、≥65岁年龄段，其余年龄段两种检测方法检测的HPV16、HPV18/45阳性率差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

HPV是一组无包膜的小DNA病毒，属乳头瘤病毒科。持续高危型HPV 感染是导致宫颈癌的主要原因，其分型检测在宫颈癌筛查中具有举足轻重的作用［3］。

表2 不同年龄段高危型阳性率比较

在本研究中，HPV DNA分型检测结果显示，阳性构成比排名前五的亚型分别为HPV52（22.13%）、HPV16（14.32%）、HPV53（13.22%）、HPV58（10.63%）、HPV51（9.12%）。尽管在世界范围内，高危型HPV基 因 型 排 序 是HPV16、HPV18、HPV31、HPV58、HPV52，但多项研究数据显示，亚洲地区HPV58、HPV52的阳性率超过HPV18［4-5］。然而，对宫颈癌患者的研究显示，HPV16和HPV18依然是最常见的感染亚型［6］。相较于HPV16、HPV18，其他高危型HPV的致癌风险相对较低。女性一生中感染HPV 的概率高达80%，其中90%的感染是一过性的，2～3年可被自身免疫清除。这就导致HPV DNA 基因分型检测在实际应用中假阳性率偏高，由此可能导致不必要的阴道镜检查，加重患者的心理压力和经济负担。因此，寻找敏感度较好且更特异的HPV检测方法是目前研究的热点。

表3 不同年龄段中两种检测方法HPV16、18/45阳性率比较 ［n（%）］

Aptima HPV E6/E7 mRNA检测作为一种宫颈癌前病变早期筛查的新技术，能有效评估宫颈上皮细胞因E6/E7 癌基因表达导致的病变程度［7］。高危型HPV 持续感染基底层细胞后，病毒E6/E7 癌基因的表达水平会受细胞分化程度和患者免疫水平的影响。HPV E6/E7 mRNA 的表达是宫颈癌发生发展的重要因素［8］。E6/E7 mRNA 检测相比DNA检测，前者能更加精准地发现具有临床重要性的感染［9］。本研究中妇女宫颈高危型HPV E6/E7 mRNA 阳性者所占比例为12.59%（2 840/22 562），低于HPV DNA 基因分型检测的高危型阳性率25.53%（7 425/29 081）。

为了更客观地比较两种检测方法阳性率的差异，本研究对这两种检测方法都包含的3 种型别（HPV16、HPV18/45）阳性率分年龄段比较。卡方检验结果显示，除55～＜65 岁年龄段、≥65 岁年龄段，其余年龄段两种检测方法中HPV16、HPV18/45 阳性率的差异均有统计学意义（P＜0.05）。这可能是因为HPV DNA 分型检测是对宿主细胞内游离状态与整合状态的HPV DNA 进行检测，特异性相对较低。而HPV E6/E7 mRNA 仅检测整合状态的病毒RNA 片段，大大减少“假阳性”出现的概率。但在55～＜65 岁、≥65岁两个年龄段，这两种检测方法中HPV16、HPV18/45 阳性率差异无统计学意义，这可能与机体清除率下降、持续性感染率增高有关。同时提示，在这两个年龄段，两种方法的筛查效率相近。

本研究按照年龄对样本进行分段，不同年龄段之间，两种检测方法中高危型阳性率的分布差异均有统计学意义（P＜0.05），说明按这种年龄段分组的研究方法有一定的临床意义。

在接受HPV DNA基因分型检测的标本中，高危型阳性率最高峰出现在＜25 岁年龄段（50.30%），与浙江、上海的报道相似［10-11］。这可能与本研究中25 岁以下年龄段就诊的女性性生活开始早、性伴侣多有关。而HPV E6/E7 mRNA检测中＜25年龄段HPV16、HPV18/45 阳性率明显低于HPV DNA 分型检测。这提示该年龄段女性机体有着良好的病毒清除能力，大部分病例仅为一过性感染。因此，对于＜25岁年轻女性，不推荐进行HPV筛查。同时，在经济条件允许的情况下，可考虑尽早接种HPV疫苗。

在接受高危型HPV E6/E7 mRNA 检测的标本中，高危型阳性率排名前二的分别是≥65岁年龄段、55～＜65 岁年龄段。这虽然与HPV DNA 分型检测的年龄分布模式不尽相同有关，但两种检测方法的结果提示这两个年龄段妇女HPV 感染率高、E6/E7阳性率高。这可能与这两个年龄段妇女体内激素水平低、波动大，易引起免疫功能失调导致病毒的再活动有关［12］。该年龄人群普遍已绝经，宫颈上皮萎缩后以中层及外底层细胞为主，细胞学检查的假阳性率比较高。因此单独进行HPV 筛查在这两个年龄段有着重要的临床意义。

此外，值得一提的是，各年龄段间两两比较，两种检测方法中，55～＜65 岁年龄段与≥65 岁年龄段间高危型阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。这就提示我们，在后续的研究中可以将这两个年龄段合并研究。

HPV E6/E7 蛋白的表达是HPV 病毒活跃的信号。与HPV DNA基因分型检测相比，E6/E7 mRNA检测能有效剔除HPV 一过性感染造成的假阳性结果，提高筛查效率，减少过度诊断和治疗。但是，目前HPV E6/E7 mRNA 检测阳性只是一个定性结果，国内外对其定量检测的最佳诊断临界点尚存在一定争议［13］，其与宫颈病变严重程度的相关性也仍需深入探讨。本次研究只对两种筛查方法进行了简单对比，二者的临床应用价值的比较还有待进一步加强。