伊立替康联合X线照射对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

席栋宾，张怀霞，徐玉珩，刘 毅，张延英

1酒泉市人民医院胃肠外科，甘肃 酒泉 735000；2甘肃中医药大学实验动物中心，甘肃 兰州 730000

结直肠癌是世界上最常见的癌症之一，也是与癌症相关死亡的第二大原因［1］。近年来，尽管发达国家的结直肠癌发病率已开始下降，但发展中国家的结直肠癌发病率仍保持急剧上升的态势［2］。外科手术是目前结直肠癌的主要治疗手段，但术后往往因发生转移或复发而影响预后［3-4］。远处转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，肝脏是结直肠癌患者最常见的转移位点［1］。辅助放化疗可以降低术后复发率和转移率、提高患者的长期生存率。伊立替康（CPT⁃11）是一种选择性拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，临床上广泛应用于肿瘤治疗，包括转移性结直肠癌复发患者以及恶化病例的治疗。有研究报道，CPT⁃11 可抑制食管癌EC109 细胞增殖并具有放射增敏作用［5］，而有关伊立替康联合X 线的联合应用对人结肠癌细胞系HCT⁃116的作用研究尚未曾报道，故本实验研究CPT⁃11 对人结肠癌细胞系体外增殖以及放射敏感性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

HCT⁃116 细胞购自中国科学院上海细胞所，CPT⁃11、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、普通RIPA 裂解液和AO 染色液均购自北京索莱宝科技有限公司，RPMI 1640 培养基和胎牛血清购自美国Gibco 公司，兔抗p53、p21 及内参GAP⁃DH 抗体购自美国Immunoway公司；CO2恒温培养箱购自美国Thermo Forma公司，酶标仪购自美国BIO⁃RAD公司，全自动蛋白质印迹定量分析系统购自美国Protein Simple 公司，荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 HCT⁃116细胞的体外培养及传代

HCT⁃116 细胞培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，加入100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素，于37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中传代培养。用倒置显微镜观察细胞生长状况，每3 d传代1 次，选对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT实验

常规消化对数期细胞后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液配制单细胞悬液，以每孔2 000个细胞密度接种到96孔板，每孔体积为200 μL。贴壁后，用不同浓度CPT⁃11（10、20、30、40、50 μg/mL）作用24 h 或单次不同剂量X 线（3、6、9、12、15 Gy）照射，每个剂量组3个复孔。继续培养48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液，继续孵育4 h，终止培养。每孔加150 μL DMSO 并振荡10 min。在酶标仪490 nm 波长处测定各孔吸光度值。细胞增殖抑制率=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。

1.2.3 克隆形成实验

常规消化对数期细胞后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液配制单细胞悬液，以每孔1 000个细胞密度接种到6 孔板，每孔体积为200 μL。贴壁后，6 Gy X线照射（照射组）或预先用10 μg/mL浓度CPT⁃11 作用24 h 后联合6 Gy X 线照射（联合处理组），继续培养10 d 后，加入5 mL 甲醇固定10 min。加入适量0.1% 结晶紫染色15 min，在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。计算公式为：克隆形成率=（克隆形成平均数/接种细胞数）×100%。实验重复3次。

1.2.4 蛋白提取和全自动蛋白表达定量分析

常规收集3 组细胞，并用预冷PBS 洗1 遍，每瓶细胞加入200 μL RIPA 裂解液于冰上裂解10 min。将裂解后的样品12 000g离心5 min，取上清，BCA法测蛋白浓度。按照Wes 标准流程上机检测，终浓度为1 mg/mL。

1.2.5 AO/EB实验

常规消化对数期细胞后，接种到6 孔板。贴壁后，6 Gy X线照射（照射组）或预先用10 μg/mL浓度CPT⁃11 作用24 h 后联合6 Gy X 线照射（联合处理组）。继续培养24 h后，加入5 mL甲醇固定10 min。加入AO/EB 工作液，室温避光染色20 min，倒置荧光显微镜下计数并拍照。吖啶橙可透过正常细胞膜，故细胞核呈绿色荧光；对于凋亡细胞，因染色质固缩或断裂形成凋亡小体，表现为黄绿色荧光。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0 统计软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组细胞增殖率比较采用广义线性模型分析，以剂量作为自变量，试验组别作为分组因素，剂量和组别的乘积作为交互因素，对不同试验组别得到的两条直线的斜率进行比较，若交互项有统计学意义，说明自变量剂量对结果变量细胞增殖率的影响在不同组别中有差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CPT⁃11对HCT⁃116细胞增殖的抑制作用

采用MTT 法检测10～50 μg/mL 的CPT⁃11 作用HCT⁃116 细胞后的增殖情况，结果显示在此范围内呈剂量依赖性抑制细胞增殖（图1）。根据以往的研究，CPT⁃11对HCT⁃116细胞的IC20为9.64 μg/mL，为避免CPT⁃11 的毒性作用，本实验选择10 μg/mL 进行后续研究。

图1 不同浓度CPT⁃11对HCT⁃116细胞增殖的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of different concentrations of CPT⁃11 on proliferation of HCT⁃116 cells

2.2 单次不同剂量X 线照射对HCT⁃116 细胞增殖的影响

对于经10 μg/mL CPT⁃11 预处理24 h 的HCT⁃116 细胞和对照HCT⁃116 细胞分别给予3、6、9、12、15 Gy X线照射，恢复24 h后，采用MTT法检测细胞增殖情况，发现联合处理组增殖抑制率大于照射组，差异有统计学意义（F=55.34，P＜0.001）。随着照射剂量的增加，联合处理组的增殖抑制作用更加明显，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 不同剂量X线照射对HCT⁃116细胞增殖的影响Figure 2 Effect of different doses of X⁃ray irradiation on proliferation of HCT⁃116 cells

2.3 CPT⁃11 联合X 线照射对HCT⁃116 细胞克隆形成的影响

通过克隆形成实验，检测对照组、照射组和联合处理组集落形成情况，结果与对照组相比，照射组和联合处理组的集落形成数量都明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；且联合处理组的集落形成数量少于照射组（P＜0.05，图3）。

图3 CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞克隆形成的影响Figure 3 Effect of CPT⁃11 combined with X⁃ray irradia⁃tion on colony formation of HCT⁃116 cells

2.4 CPT⁃11 联合X 线照射对HCT⁃116 细胞凋亡的影响

与对照组相比，照射组和联合处理组的凋亡率均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且联合处理组的凋亡率更高，明显大于照射组（P＜0.05，图4）。

图4 CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of CPT⁃11 combined with X⁃ray irradia⁃tion on apoptosis of HCT⁃116 cells

2.5 CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞p21、p53表达的影响

X线照射后，恢复6 h，与对照组相比，照射组和联合处理组的p21 和p53 蛋白均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且联合处理组的p21 和p53 蛋白水平高于照射组（P＜0.05，图5）。

3 讨论

图5 CPT⁃11 联合X 线照射对HCT⁃116 细胞p21、p53 表达的影响Figure 5 Effect of CPT⁃11 combined with X⁃ray irradia⁃tion on the expression of p21 and p53 in HCT⁃116 cells

CPT⁃11 是喜树碱（camptothecin，CPT）的一种水溶性半合成衍生物。因为CPT⁃11 的广泛抗肿瘤活性，临床上用于肺癌、胃癌、卵巢癌和淋巴癌等多种肿瘤的治疗［6］。在DNA复制以及转录过程中，其通过与拓扑异构酶⁃1（Topo⁃1）结合，共同形成DNA Topo⁃1复合物。在此过程中，CPT⁃11及活性代谢产物（SN⁃38）可以通过与该复合物结合，从而阻断DNA 复制而达到抗肿瘤作用［7-8］。目前，CPT⁃11已获批用于转移性结直肠癌的辅助治疗，而以往的多项研究也发现其联合放疗时能增加放疗效果［5，9-11］。在伊立替康联合放疗治疗小细胞肺癌脑转移患者的报道中，其可显著降低患者的病死率，改善患者的生存状况［11］，并且该治疗方法的有效性和安全性均较高，可有效提高疾病控制率，减少不良反应，提高患者的耐受程度。此外，CPT⁃11可有效抑制放疗早期宫颈癌细胞的增殖，提高放疗诱导的癌细胞凋亡率，结果显示宫颈肿瘤50%消退时间明显缩短，肿瘤体积缩小［9］。大多数放疗增敏剂的作用机制是，通过抑制细胞增殖并诱导凋亡来增强放射线对细胞的杀伤作用，故本研究进一步探讨CPT⁃11联合X 线照射对人结肠癌细胞HCT⁃116 增殖和凋亡的影响。

CPT⁃11 的主要不良反应是骨髓抑制和胃肠道不良反应，呈剂量依赖性，严重的腹泻反应限制了其临床应用。本研究结果显示，在10～50 μg/mL 范围内，CPT⁃11呈浓度依赖的方式抑制HCT⁃116细胞增殖，与以往研究报道一致。为进一步研究CPT⁃11联合X 线照射对HCT⁃116 细胞的放疗增敏效果，本研究选择10 μg/mL的CPT⁃11处理，约为CTP⁃11 对HCT⁃116 细胞的IC20浓度，毒性较轻。在MTT 实验和克隆形成实验中，与对照组和照射组相比，联合处理组增殖率明显提高，且随着照射剂量的增加，联合处理组的增殖抑制作用更加明显。CPT⁃11 在较低浓度下即具有增殖抑制和放射增敏作用，提示其临床应用中可采用低浓度CPT⁃11 联合X 线照射来提高结直肠癌的治疗效果，既可以减轻不良反应，还可以减轻患者负担、提高生存率。

放射治疗引起肿瘤细胞DNA 损伤进一步引起凋亡，是肿瘤治疗的基本策略。为进一步研究CPT⁃11 联合X 线照射对HCT⁃116 细胞凋亡的影响，AO/EB染色结果显示联合处理组细胞凋亡率显著提高，Western blot 检测其p21和p53蛋白水平也高于照射组，进一步提示应用CPT⁃11可增加HCT⁃116对X线照射的敏感性，诱导其凋亡。p53 是细胞内重要的抑癌基因，广泛参与DNA 损伤修复、细胞周期调控和凋亡等过程，对维持基因组的完整性和稳定性至关重要［12］。本研究中，HCT⁃116 细胞接受电离辐射及CPT⁃11处理后时，p53 能被迅速激活进而促进多种重要下游靶基因如p21 的激活，从而促进凋亡的发生。

综上所述，CPT⁃11 可抑制食管癌HCT⁃116细胞增殖并具有放射增敏作用，同时诱导凋亡，为临床上结肠癌的治疗提供一定的理论基础。