响应内生菌侵染的两个地黄茉莉酸合成关键基因的克隆与表达分析

彭淑萍 董诚明，2 朱畇昊，2*

（1. 河南中医药大学药学院，郑州 450046；2. 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，郑州 450046）

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）为玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）植物，地黄的块根作为中药使用，是四大怀药之一。地黄不仅具有滋补功效而且还具有清热养血、养阴生津等作用［1］。地黄的化学成分包括环烯醚萜及其苷类、苯乙醇及其苷类、萜类及其苷类、挥发油、黄酮类［2～3］，以环烯醚萜苷类为主，而在环烯醚萜苷中以梓醇的含量最高。

植物次生代谢产物是一大类小分子化合物，在植物体中的基础含量一般都很低。然而在生物压力胁迫（昆虫取食、病原菌或内生菌侵染）和非生物的压力胁迫（机械损伤、植物激素）下，或者在一定的诱导条件下，次生代谢产物的产量通常有一定的提高［4～6］。例如，盐胁迫下西红柿中茉莉酸等在植物中大量的积累［7］。激素之间进行相互作用，进一步调控植物次生代谢过程。茉莉酸是一种普遍存在于植物中的重要次级代谢产物，而且作为一类植物激素，其对植物的生长发育、系统防御以及次级代谢产物的合成起着关键的调控作用［8～9］。如，外源茉莉酸能减轻受侵染水稻稻瘟病发病症状，并诱导水稻防御相关基因不同程度的上调表达［10］，茉莉酸作为信号分子在内生真菌与茅苍术拮抗平衡中起到特定作用［11］。

茉莉酸的生物合成途径主要有从亚麻酸开始的十八烷途径和从十六碳三烯酸开始的十六烷途径。其中，丙二烯合酶（allene oxide synthase，AOS）催化13-氢过氧化亚麻酸（13-HPOT）形成12，13-环氧十八碳三烯酸（12，13-EOT），后者在后续酶的催化下形成Jas 合成途径中的关键中间产物12-氧代植二烯酸（OPDA）。OPDA 在12-氧代植二烯酸还原酶（12-oxophytodienoate reductase，OPR）还原后，再经3次氧化最后形成茉莉酸。因此，AOS和OPR均是植物体内茉莉酸合成途径的关键酶。AOS 属于P450 超基因家族中的一员，普遍存在于植物组织中［12］。水稻AOS 家族共有4 个成员［13］；陆地棉AOS基因家族有6个成员［14］，地黄转录组数据库中有2 条Unigene 被注释为AOS 基因；OPR 隶属于古老黄酶（Old yellow enzyme，OYE）家族，是一种黄素单核苷酸（Flavin mononucleotide，FMN）依赖的氧化还原酶［15］。在许多高等植物中相继发现了OPR 基因，番茄OPR 基因家族有3 个成员［16］，豌豆OPR 基因家族有6 个成员［17］，玉米OPR 基因家族有8 个成员［18］以及水稻OPR 基因家族有13 个成员［19］，地黄转录组数据库中有6 条Unigene 被注释为OPR 基因。目前，在许多种植物中克隆了AOS和OPR 基因并进行了相关功能的研究，如：金银花［20］、长春花［21］、茛菪［22］、青蒿［23］、白木香［12］等植物的AOS 基因已经被克隆，甘蔗［24］、葡萄［25］、金鱼草［26］等植物的OPR 基因也已经被克隆，于地黄AOS 和OPR 基因的克隆及其功能分析的研究尚未见报道。本课题组前期通过比较内生真菌GG22侵染前后地黄无菌苗转录组的差异，分别注释到一条能被GG22 诱导的AOS 和OPR 基因。本研究通过逆转录PCR技术，利用被内生真菌GG22侵染29 d的地黄无菌苗cDNA 为模板，克隆获得了地黄AOS（GenBank登录号MN846745）和OPR（GenBank登录号MN846746）基因，并对其进行了生物信息学分析、组织特异性表达及其在GG22侵染不同时间的表达特性分析，为深入验证两基因的相关功能和在地黄内生真菌侵染过程中扮演的角色奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

地黄（R.glutinosa Libosch）种植于河南中医药大学植物园，于开花时挖取地黄植株整株，洗净后分别取根、叶、花组织，提取总RNA，检测AOS 和OPR基因在不同器官中的特异性表达。

地黄无菌苗培养于河南省道地药材生态种植工程技术研究中心实验室。将地黄无菌苗接种在1/2MS的固体培养基，地黄苗在该培养基中生长大约至5 cm 时，再次将其接种于蛭石培养基中，3～4 d 后，将已经活化的内生真菌GG22 涂布与载玻片上，面积为1 cm×1 cm，载玻片距离地黄苗无菌苗根部大约1 cm。然后于共培养3、12 和29 d 取样，作为实验组，未经内生真菌侵染的作为空白组，提取总RNA，检测地黄无菌苗中AOS 和OPR 基因在GG22侵染不同时间的表达特性。

1.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

采用Trizol试剂法（Thermo Fisher Scientific）提取上述不同样品总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。前期课题组对内生真菌GG22 侵染地黄后的转录组研究发现，GG22接种后期，地黄中AOS和OPR的表达量最高，因此，我们以GG22接种29 d 的样品作为克隆目的基因的模板，参照TIANScript cDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）说明书进行cDNA第一链合成。

1.3 目的基因的克隆

将地黄cDNA稀释5倍，作为模板，使用表1中特异引物进行扩增。反应体系为cDNA 2.0µL，2×Es Taq mix 10.0 µL，正反向引物各1.0 µL，ddH2O 6.0 µL，反应体系总体积为20.0 µL。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35 个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物并回收目的条带。将回收的片段与pMD19-T 载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，经过蓝白班选择挑选阳性克隆后送测序验证。

1.4 生物信息学分析

使用ORF finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）进行开放阅读框查找；使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列的同源性搜索；使用Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）预测蛋白的分子量等理化性质；使用SinalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白信号肽；使用TMpred（https：//embnet. vital-it. ch/software/TMPRED_form.html）预测蛋白跨膜区；使用NPSA server（http：//npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_sopm.html）预测蛋白二级结构，使用PSORT（https：//www.psort.org/）预测蛋白亚细胞定位；使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白功能域；使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测蛋白磷酸化位点；使用MEGA6.0 构建系统和进化树，使用DNAMAN 进行多序列比对。

1.5 实时荧光定量PCR

根据基因序列，使用Primer5.0 设计特异性定量PCR 引物。以TIP41 基因为内参基因，利用SYBR Green 染料法，分析目的基因在不同地黄组织（根、叶和花）以及内生真菌侵染前后的基因表达特性。反应体系：SYBR Green PCR Master Mix 10 µL、正反向引物各0.4 µL、QN Rox Reference Dye 0.1µL、ddH2O 7.1µL、模板cDNA 2µL。扩增条件：95℃20 s；95℃1 s；56℃20s；95℃1 s。40个循环。65～95℃进行熔解曲线分析，根据熔解曲线判断产物的特异性，反应结束后，根据得到的Ct值，利用2-ΔΔCt，分别计算不同组织的表达量。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取及目的基因的克隆

取4µL 的总RNA 经1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果显示提取的RNA条带比较清晰，具有18S 和28S 两条清楚的条带，表明所提取的RNA完整性比较好。

以内生真菌GG22侵染29 d的地黄叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，采用凝胶电泳检测PCR的结果，均扩增出约1 700 bp的目的条带。测序结果表明，其核苷酸序列与转录组库中序列一致，经ORF Finder 分析，二者均包含有一个与目的基因大小一致的完整的开放阅读框。其中RgAOS 基因ORF 长度为1 626 bp，编码541 个氨基酸。利用在线软件SMART 对其进行功能域预测，结果表明该基因编码蛋白被注释为CYP450超蛋白家族，保守域位于第366 位至第524 位。进一步序列分析表明，其归属于P450 超基因家族中的CYP74A 亚族。其序列具有以下结构域：①高度保守的I-Helix Region；②具有P450超基因家族中CYP74A亚族高度保守的ETLR 结构域；③具有高度保守序列血红素结合结构域。

RgOPR 基因ORF 长度为1 197 bp，编码398个氨基酸。利用在线软件SMART 对其进行功能域预测，结果表明该基因编码蛋白被注释为古老黄酶超蛋白家族，保守域位于第12 位至第363 位。进一步序列分析表明，其序列具有以下结构域：①12-oxophytodienoate reductase 活性位点；②OYE 家族FMN 结合域；③2，4-二烯酰辅酶A 还原酶或相关的NADH 依赖性还原酶活性位点；④古老黄酶的酵母蛋白和来自大肠杆菌的FadH（2，4-二烯酰CoA还原酶活性位点。

2.2 目的基因氨基酸序列特征分析

RgAOS 蛋白分子量为60.20 kD，等电点为9.06。亲水性的总平均值GRAVY 为-0.232，推测该蛋白为亲水性蛋白。SignalP 结果表明该蛋白没有信号肽。利用TargetP 在线预测软件推测该蛋白可能定位在线粒体中。用SOPMA 预测蛋白质二级结构，结果显示该蛋白由40.67%的α 螺旋（Alpha helix），4.62%的β 转角（Beta turn），14.79%的延伸主链（Extended strand）和39.93%的无规则卷曲（random coil）构成。

RgOPR 蛋白分子量为44.07 kD，等电点为7.72。RgOPR 蛋白编码398个氨基酸，亲水性的总平均值GRAVY 为-0.269，推测该蛋白为亲水性蛋白。利用TargetP 在线预测软件推测该蛋白可能定位在细胞质中。用SOPMA 预测蛋白质二级结构，结果显示该蛋白由34.67%的α 螺旋、17.09%的延伸链、10.30%的β-转角、37.94%的无规卷曲构成。

2.3 目的基因同源进化分析

从NCBI 数据库中下载芝麻（Sesamum indi⁃cum）、水曲柳（Erythranthe guttata）、油橄榄（Olea europaea var.sylvestris）、番薯（Ipomoea nil）、美花烟草（Nicotiana sylvestris）、野生烟草（Nicotiana atten⁃uata）、野生种潘那利番茄（Solanum pennellii）、马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersi⁃cum）、红薯（Ipomoea batatas）、猫耳朵（Dorcoceras hygrometricum）、金银花（Lonicera japonica）、月季（Rosa chinensis）、野草莓（Fragaria vesca subsp. ves⁃ca）、柠檬辣椒（Capsicum baccatum）、辣椒（Capsi⁃cum annuum）、黄灯笼辣椒（Capsicum chinense）、毛茸烟草（Nicotiana tomentosiformis）、雷蒙德氏棉花（Gossypium raimondii）、陆地棉（Gossypium hirsu⁃tum）、梅花（Prunus mume）等物种中AOS 蛋白的氨基酸序列。利用MEGA6 软件将上述下载的氨基酸序列与RgAOS蛋白的氨基酸序列构建系统进化树。根据进化树结果显示，RgAOS 与双子叶植物胡麻科植物芝麻SiAOS 亲缘关系比较近，他们处于进化树的同一个分支上。

报道显示OPR 蛋白对催化的底物具有偏好性，基于结合底物的特异性可将其划分为OPRⅠ和OPRⅡ两大类，其中OPRⅡ催化形成JA。从NCBI 数据库中下载芝麻（S.indicum）、紫花风铃木（Handroanthus impetiginosus）、合瓣花（Erythranthe guttata）、油橄榄（O.europaea var.sylvestris）、旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）、毛萼香茶菜（Isodon eriocalyx）、猕猴桃（Actinidia chinensis var.chinen⁃sis）、山茶（Camellia sinensis）、木薯（Manihot escu⁃lenta）、鼠尾草（Salvia splendens）、潘那利番茄（S.pennellii）、伊德斯种咖啡（Coffea eugenioides）、野生烟草（Nicotiana attenuata）、马铃薯（Solanum tu⁃berosum）、番茄（S.lycopersicum）、小果咖啡（Coffea arabica）、裂叶牵牛（Ipomoea nil）、蓖麻（Ricinus communis）、茸毛烟草（Nicotiana tomentosiformis）、辣椒（C.chinense）、浆果状辣椒（Capsicum bacca⁃tum）、东方苔草（Trema orientale）、美花烟草（N.syl⁃vestris）、葡萄（Vitis vinifera）、榴莲（Durio zibethi⁃nus）、麻风树（Jatropha curcas）、普通烟草（Nicotia⁃na tabacum）、棉花子（Gossypium arboreum）等物种中的OPRⅡ蛋白氨基酸序列，利用MEGA6 软件将上述下载的氨基酸序列与RgOPR蛋白的氨基酸序列构建系统进化树。根据进化树结果显示，RgOPR 蛋白与其他OPRⅡ蛋白亲缘关系较近，推测其可能参与JA 的生物合成。RgOPR 蛋白与紫葳科植物紫花风铃木HiOPR 和胡麻科植物芝麻SiOPR的亲缘关系较近。

2.4 组织表达特性分析

利用实时荧光定量PCR 法，分析目的基因在地黄不同组织中表达特性。由图3知，RgAOS基因在地黄3 个组织中均有表达，其在根中表达量最高，叶中次之，而花中最少。

由图3可知，RgOPR基因的表达模式与RgAOS不同，其地黄3 个组织中的表达也有一定差异，其表达量在叶中最高，花次之，在根中的表达量最低。且花和叶中的表达量较接近，远高于根中的表达量。

2.5 地黄组培苗受GG22侵染后的差异表达

利用实时荧光定量PCR 法，分析目的基因在GG22 侵染不同时间的表达特性。如图4 所示，RgAOS 基因的表达在内生真菌GG22 侵染后发生了变化。在侵染初期，RgAOS 基因的表达有少许降低，而在侵染的中期、后期，其表达量均较对照组显著增加，且在侵染29 d 时的地黄苗中的表达量最高。在内生真菌GG22 侵染的不同阶段的表达量也不相同。在GG22侵染3 d时，其表达量与未接菌对照组差异不大，而在侵染12和29 d时，接菌组表达量均高于对照组。基于以上表达分析，我们推测，RgAOS 和RgOPR 基因均能响应内生真菌GG22的侵染，继而引发后续茉莉酸类物质的积累。

3 讨论

茉莉酸类物质是一种普遍存在于植物中的重要次级代谢产物，而且作为一类植物激素，其对植物的生长发育、逆境胁迫等方面起着关键的调控作用［27～28］，因此对JAs 在植物体内生物合成途径相关基因的挖掘及分析，有助于从分子水平了解该类基因在植物发育、系统防御及次生代谢调控中的作用。

丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase，AOS）是茉莉酸类物质合成途径中的第一个限速酶。对AOS 基因拟南芥敲除突变体与野生型都给予伤害处理，1 h 后野生型的内源JA 上升100 倍，而突变体的内源JA 无变化［29］。在拟南芥和烟草中过表达AOS 基因，给予伤害后，茉莉酸的含量高出未转化植株的2～3 倍［30］。这些均说明AOS 基因在拟南芥内源JA 合成过程中发挥着重要作用。OPR 属于古老黄酶（Old Yellow Enzyme，OYE）家族，拟南芥OPR 缺失的突变体中，JA 合成功能缺失，但其在伤诱导下可致使OPDA 积累，这说明OPR 是催化OPDA 形成JA 的过程中必不可少的关键酶。由于AOS 基因和OPR 基因在JA 生物合成途径中的重要性，许多植物中二者已经被克隆，并进行了功能分析，而关于地黄中AOS 基因和OPR基因的研究还未见报道。本研究首次克隆获得了地黄茉莉酸生物合成关键酶基因RgAOS 和RgO⁃PR，其中RgAOS 基因序列全长为1 626 bp，编码541 个氨基酸；RgOPR 基因序列全长为1 197 bp，编码398个氨基酸。

研究表明，AOS 基因和OPR 基因表达均具有组织特异性。长春花CrAOS 基因在根中表达量最高，中期叶中次之，花中表达量最低［21］。而白木香AsAOS 基因在茎中表达量最高，根次之，叶中的表达量最少［12］。拟南芥AtOPR 在花器官中高表达。唐菖蒲GhOPR 在籽球和匍匐茎中表达量较高，在根中的表达量最低［31］。本研究表明，RgAOS 和RgOPR 的表达在不同和组织中存在差异，RgAOS基因的表达模式与长春花CrAOS 基因相似，在根中表达量最高，叶中次之，而花中最少。RgOPR 表达模式与唐菖蒲GhOPR 相似，均在根中的表达量最低，而在花中较高。

茉莉酸作为一种重要的植物激素，当植物遭受各种生物和非生物胁迫时，体内的茉莉酸类物质的积累发生变化。植物AOS基因和OPR 基因作为JA 生物合成的关键基因，当植物受到外界的各种生物和非生物胁迫时，其表达也会发生变化。如：低温、盐和镉胁迫都诱导白木香AsAOS 基因的表达，而干旱胁迫对其表达影响较小［12］。长春花CrAOS 的表达可被机械损伤及低温诱导［21］。玉米ZmOPR 基因受多种逆境如损伤、病原菌等胁迫的诱导［32］。霜霉病菌、机械伤害、低温和热激胁迫均能诱导不结球白菜BcOPR 基因表达［33］。本课题组从地黄不同部位分离出了一系列内生真菌中，经初筛和复筛后发现，内生真菌GG22能够明显增加地黄梓醇及毛蕊花糖苷等次生代谢产物的含量。通过进一步比较内生真菌GG22 侵染前后地黄无菌苗转录组的差异发现，地黄RgAOS 和RgOPR 基因在GG22 侵染后表达量显著增加。本研究在前期基础上，利用实时荧光定量PCR 技术分析了二者在GG22 侵染不同时间的表达特性，结果发现，接种GG22 第12 天后，RgAOS 和RgOPR 基因的表达均被诱导。结合前期次生代谢产物的研究结果，我们推测，当内生真菌GG22 侵染地黄无菌苗后，JAs 生物合成关键酶RgAOS 和RgOPR 被诱导，导致JAs含量的积累，从而同启动植物抗逆基因的表达，导致地黄中次生代谢途径的变化，使梓醇及毛蕊花糖苷等次生代谢的合成加速。在以后的研究中，我们可以利用本研究克隆的RgAOS 和RgO⁃PR 基因，构建单一基因或双基因的过表达或基因敲除的转基因材料，测定转基因材料中茉莉酸类物质的含量，从而推测RgAOS 和RgOPR 基因在茉莉酸类物质生物合成中的作用。进一步检测转RgAOS和RgOPR基因的地黄中次生代谢产物的变化规律，进一步明确茉莉酸类物质在地黄次生代谢产物合成中的调控作用。