复方生地提取液对银屑病模型小鼠炎症水平的影响

★ 李雄英 艾瑛 徐云 邹立君 何平平 刘少雄 王英（江西中医药高等专科学校 江西 抚州344000）

银屑病是一种以角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润和新生血管形成为主要组织病理改变的慢性炎症性皮肤病，其患病数占全世界皮肤病患病总数的0.4 %～0.6 %，占自然人群患病总数的0.1 %～0.3 %［1］。该病极易复发且难以根治，是皮外科重点研究疾病之一［2-4］，目前用于系统治疗银屑病有效的西药制剂主要有细胞毒及免疫抑制剂、维甲酸类、抗生素类及生物制剂等［5-6］，但依然不能根治或导致多种毒副作用，因此积极研究高效、低毒副作用的治疗银屑病的药物制剂具有重要意义。复方生地提取液用于血热型银屑病的治疗已取得了满意的临床疗效，但其主要药效学基础及可能作用机制不明确。本实验采用注射己稀雌酚制备银屑病模型，观察复方生地提取液对模型小鼠阴道细胞有丝分裂影响，并进一步检测血液炎症因子探讨其可能的作用机制，为其临床用药提供一定药理学依据。

1 实验材料

1.1 动物 雌性ICR小鼠72只，6～8周龄，SCXK（浙）20080033，合格证号：0019405，由浙江省医学科学院实验动物中心提供。

1.2 药物及其配制 造模材料：己烯雌酚批号（20131001）、秋水仙碱批号（20140210）；受试药：复方生地提取液配制成低、中、高三种剂量（0.02、0.04、0.08 g/kg），由杭州市第三人民医院提供（批号：140320）；阳性对照药：复方青黛胶囊批号（140403），用前配成0.4 mg/mL，备用。

1.3 实验试剂 无水乙醇（批号20140725，杭州龙山精细化工有限公司）；95%乙醇（批号140803601，安徽安特食品股份有限公司）；二甲苯批号（20140901，中国杭州化学试剂有限公司）；盐酸批号（20130621，衢州巨化试剂有限公司）；氨水批号（20091022，杭州长征化学试剂有限公司）；中性树脂批号（20130830，中国上海标本模型厂）；伊红批号（20140919，南京建成科技有限公司）；苏木批号（20141014，南京建成科技有限公司）；盖玻片批号（10212450C，江苏世泰实验器材有限公司）；石蜡（批号20140516，上海华灵康复机械厂）。

1.4 仪器 MEIKO EC360包埋机（美康仪器设备制造高淳县有限公司）；自动脱水机（SAKURA Tissue-Tek VIP 5Jr）；LEICARM2245切片机（德国LEICA公司）；ZPJ-1A展片机（d航机械设备厂）；生物显微镜B5-223IEP（Motic公司）；Adavance3.2图像分析系统（Motic公司）；MEIKO FT100展片机（美康仪器设备制造高淳县有限公司）；DHG-9140烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；生物显微镜B5-223IEP（Motic公司）；Adavance3.2图像分析系统（Motic公司）；载玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；Microcl17微量离心机（美国Thermo公司）。

2 方法

2.1 动物分组 雌性ICR小鼠72只，6～8周龄，分为6组，分别为正常对照组、银屑病模型组、复方生地提取液低剂量组（0.2 g/kg）、复方生地提取液中剂量组（0.4 g/kg）、复方生地提取液高剂量组（0.8 g/kg），阳性对照组（复方青黛胶囊），每组12只。

2.2 造模与给药 除正常对照组小鼠腹腔注射（ip）给予每10 g体重0.1 mL生理盐水外，其余各组均腹腔注射己烯雌酚10 mg/kg，每日1次，连续3 d（3 d后隔天注射1次，至实验结束），使小鼠阴道上皮处于增生状态。除正常对照组和模型组给予生理盐水外，其余各组于第3天给予相应药物，每日1次，连续30 d。模型制备参考施惠娟研究氧化苦参碱对银屑病模型雌激素周期小鼠阴道上皮细胞增殖和凋亡的影响［8］。

2.3 指标测定

2.3.1 小鼠血清炎症指标的测定 末次给药后，除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射秋水仙碱2 mg/kg，使细胞分裂停滞于有丝分裂期。6 h后取血，采用酶勉法测定血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、内皮素ET-1、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、细胞粘附分子（VCAM-1）及血管内皮生长因子（VEGF）水平探讨其可能作用机制。

2.3.2 小鼠阴道病理学观察 取血完毕后，迅速处死小鼠并取阴道组织，放入4 %中性福尔马林中固定3 d后，经取材-固定-水洗-脱水-包埋-切片-HE染色等步骤制备阴道病理学切片，在光学显微镜下观察阴道细胞的有丝分裂，并计数100个阴道基底细胞中所出现的有丝分裂细胞数，即基底层细胞有丝分裂指数。

3 统计学方法

4 实验结果

4.1 对银屑病模型小鼠血清炎症因子的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠炎症因子血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、血清白介素-8（IL-8）、血浆细胞粘附分子（VCAM-1）、血浆血管内皮生长因子（VEGF）水平明显升高（P＜0.05,0.01）。与模型对照组比较，复方生地提取液低、中剂量（0.2 g/kg）能明显降低模型小鼠血清TNF-α、血浆VEGF水平（P＜0.05，0.01）；高剂量（0.8 g/kg）能明显降低模型小鼠血清TNF-α、VEGF、IL-8、及VCAM-1水平（P＜0.05，0.01）。提示复方生地提取液对模型小鼠血清炎症因子有明显的改善作用。结果见表1。

表1 对银屑病模型小鼠血清炎症因子的影响（±s，n=12）

表1 对银屑病模型小鼠血清炎症因子的影响（±s，n=12）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，* P＜0.05，**P ＜0.01。

剂量 NO NOS ET-1 TNF-α VCAM-1 VEGF IL-8 IL-2 IL-6组别/g·kg-1 /μmol·L-1 /μm·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 （pg/mL）正常对照组 - 39.58±6.15 32.19±5.27 60.99±8.79 127.25±8.88 3.75±0.58 497.56±45.59 118.24±11.26 32.26±1.99 109.33±6.54模型对照组 - 50.07±8.40△△ 41.06±5.48△△ 74.90±8.28△△ 138.50±9.52△△ 4.43±0.38△△ 592.43±62.77△△ 137.18±12.18△△ 35.65±2.85△△ 117.61±5.94△△复方青黛胶囊 0.5 44.06±7.32 37.85±5.19 69.25±9.66 130.34±8.71* 3.78±0.54** 508.01±53.15** 125.15±11.80* 33.64±2.07* 111.92±6.20*复方生地提取液 0.2 43.79±9.07 37.43±5.76 68.16±5.61* 131.42±9.32* 3.98±0.59 526.81±38.49** 131.81±6.61 34.61±1.92 115.45±7.91复方生地提取液 0.4 43.31±6.24* 36.71±5.05* 64.71±9.13* 130.89±9.77* 4.14±0.59 519.03±79.12** 128.63±18.85 34.05±1.33* 113.51±4.99*复方生地提取液 0.8 43.11±10.93* 36.18±4.87* 63.22±9.01* 131.17±8.32* 3.82±0.43** 508.13±34.73** 125.63±14.37* 33.78±1.95* 112.18±7.87*

4.2 对银屑病模型小鼠阴道病理组织影响 正常对照组小鼠的阴道组织均被覆分化良好的鳞状上皮，基底层偶见处于核分裂相的细胞。模型对照组小鼠的阴道基底层细胞均增生活跃，有较多细胞核深染，呈不规则的分裂或多核状态，体积增大，提示模型复制成功，Van Scott［9］提出的腹腔注射己烯雌酚使小鼠阴道上皮处于增生状态模拟人类银屑病表皮增生加速特点，可较好地反映细胞增殖情况，施惠娟［8］、刘冬平［10］等均采用此方法制备银屑病模型小鼠。复方生地提取液组的基底层处于核分裂相的细胞较模型组减少。与正常对照组比较，模型对照组小鼠阴道上皮细胞基底层细胞有丝分裂指数显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，复方生地提取液高（0.8 g/kg）可显著降低阴道上皮基底细胞的有丝分裂指数（P＜0.05）。提示复方生地提取液可改善模型小鼠银屑病表皮增生过快病理生理特点。结果见表2、图1。

表2 对银屑病模型小鼠阴道细胞有丝分裂指数的影响（±s，n=12）

表2 对银屑病模型小鼠阴道细胞有丝分裂指数的影响（±s，n=12）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P ＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 给药剂量/g·kg-1 有丝分裂指数/%正常对照组 - 3.17±0.75模型对照组 - 16.00±7.54△△复方青黛胶囊 - 9.17±3.37*复方生地提取液 0.2 11.00±6.10复方生地提取液 0.4 12.00±5.62复方生地提取液 0.8 8.50±4.09*

图1 各组小鼠阴道HE染色

5 讨论

银屑病（中医学称之为“白疕”）是一种以皮肤代谢发生障碍产生慢性鳞屑性皮损为主要特征的疾病，一旦发作，则红斑色鲜、肌肤灼热、瘙痒剧烈且反复难愈。中医理论认为，银屑病是由风邪客于皮肤，血燥不能荣养所致。现实生活中外感风邪致风寒或情志内伤致郁结不舒或饮食不节致湿邪内蕴而化热，最终热邪蕴于营血，耗伤阴血，血虚风燥而致病，因此银屑病治疗应以清热凉血、清热解毒为主要治则。复方生地提取液用于血热型银屑病的治疗已取得了满意的临床疗效；复方生地提取液以生地、牡丹皮清热凉血为君药；黄芩、金银花、连翘清热解毒为臣药；当归、赤芍活血祛瘀，茯苓皮利水渗湿共为佐药；甘草调和为使药，诸药合用，共奏清热凉血、清热解毒之效。

银屑病表皮的病理生理主要特点之一为增生过快，而雌激素周期小鼠阴道上皮增生活跃，有丝分裂增多，细胞转换加快；本实验采用雌激素己烯雌酚小鼠腹腔注射，模拟了人类银屑病表皮增生过快的特点，比较小鼠阴道基底细胞有丝分裂指数，可较好地评价药物抑制细胞有丝分裂作用。实验结果显示，复方生地提取液0.8 g/kg能显著降低模型小鼠阴道有丝分裂指数，抑制雌性小鼠阴道上皮细胞有丝分裂，提示复方生地提取液可改善银屑病表皮增生过快病理生理特点。

银屑病是一种以角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润和新生血管形成为主要组织病理改变的慢性炎症性皮肤病，免疫异常及血管增生是银屑病的重要机理，特别是T淋巴细胞的活化和细胞因子的释放在银屑病的发病和维持其基本病理特征方面起关键性作用［11］。促炎症细胞因子如肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白介素 -6（IL-6）［12］、白介素 -8（IL-8）、白介素 -2（IL-2）［13］等与银屑病的发生、发展有密切的关系。①肿瘤坏死因子-α是巨噬细胞受到脂多糖(类毒素)等刺激而释放，可通过诱导蛋白酶抑制剂的表达而影响角阮细胞的再生分化和导致表皮中中性白细胞的浸润；它还作用于表皮成纤维细胞，使其发生表型改变；另外，TNF-α还可诱导角质形成细胞增加表达细胞问粘着分子-1，从而促进炎性细胞在皮肤的浸润，进一步产生一系列炎症反应。②IL-8又名粒细胞趋化蛋白、中性粒细胞激活因子等，在银屑病的发病机制中充当很强的白细胞趋化剂和Kc的丝裂原，在介导T细胞和中性粒细胞浸润中可能起关键作用；银屑病患者皮损［14］和血清［15］中有高水平IL-8。③细胞粘附分子（VCAM-1）属于免疫球蛋白超家族中的一员，能够促进炎症细胞在血管内皮沉积和黏附，在炎症性皮肤病的致病中发挥重要作用，银屑病患者血浆中有高水平VCAM［16］。④血管异常是银屑病发生、发展全过程的关键，而血管异常是整个免疫系统及各种细胞、炎症因子表达紊乱的结果。血管内皮生长因子（VEGF）具有促进内皮细胞增生、增加血管通透性、诱导血管生成和参与血管重塑等多种功能，是目前发现的最重要的促血管新生物质之一［17］。实验结果显示，复方生地提取液能显著降低模型小鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、内皮素ET-1、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、细胞粘附分子（VCAM-1）及血管内皮生长因子（VEGF）水平，提示复方生地提取液可能通过调节炎症水平改善银屑病。

综上，复方生地提取液既可抑制表皮增生过快，改善皮损病症；亦可降低血清促炎症细胞因子，改善机体炎症病变，消除病因；对银屑病模型有较明显的疗效，标本兼治。