还原氧化石墨烯对人原代成纤维细胞的毒性研究

付 翔，李明新，彭驰伟，王凯旋*

(1.桂林医学院附属医院，广西 桂林 541001；2.唐山中心医院，河北 唐山 063000)

石墨烯(graphene)是一种单原子层石墨，是零维富勒烯的基本结构单元,具有超薄、超高强度等特性，被广泛应用于超轻防弹衣、超薄超轻型飞机材料等领域[1]。氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO)是石墨烯最重要的2种衍生物[2]。rGO具有细胞毒性，并且还原度越高的rGO细胞毒性越大；与GO相比，rGO更易黏附在细胞表面[3]。石墨烯及其衍生物具有高度的生物相容性、低毒性和大剂量的负载能力[4]，近10年来，在生物医学方面的研究受到了前所未有的关注[5]，但其在再生医学的应用尚处于早期阶段[6]。

成纤维细胞(fibroblasts)是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，主要存在于疏松结缔组织中，能合成和分泌大量胶原蛋白，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用[7]。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用[8-10]。研究发现，成纤维细胞具有不同类型，它们的独特性能可帮助修复受损皮肤，并降低年龄老化对皮肤的影响[11]。通过皮肤表皮信号的刺激可增加成纤维细胞的数量，有助于伤口愈合过程中毛囊的形成，进而降低皮肤愈合后落下疤痕的几率[12]。

目前，文献报道的大多是GO或石墨烯薄膜在医学方面的研究，对rGO毒理特性的报道较少。但rGO是新型骨架材料的优良选择，有必要研究其对细胞的毒性。因此，作者用GO制备rGO，通过CCK8法细胞活性检测及细胞划痕实验研究rGO对人原代成纤维细胞的毒性。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

人表皮组织，由桂林医学院附属医院提供。

氧化石墨烯(GO)，江苏先丰纳米材料科技有限公司；DMEM/F12(1∶1)培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液，美国GIBCO公司；胎牛血清(FBS)，巴西Lonsera公司；CCK8试剂盒，日本同仁化学研究所。

CO2细胞培养箱、离心机，德国艾本德公司；超净工作台，上海苏净实验设备公司；YXQ-IS-75SⅡ型压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；IX73型倒置荧光显微镜，日本Olympus公司；细胞计数盘，南宁精密仪器厂；Infinite F200型连续光栅型酶标仪，瑞士Tecan公司；纯水超纯水制作系统，Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 rGO溶液的制备

将GO平铺于盛有石墨的带盖平面器皿上，放入微波炉中高温微波10 s，得到黑色物质，轻轻用镊子将其移入另一个器皿中，轻触器皿壁使之铺平，再高温微波10 s[13]，即得rGO。用蒸馏水配制成浓度为1.0 mg·mL-1的rGO母液，再稀释成不同浓度(0、5、10、15、20、25、30、35、40，μg·mL-1)，备用。

1.2.2 人原代成纤维细胞的提取

将人表皮组织放入预冷的75%酒精中浸泡，然后移至超净台，Hanks液清洗3次后用剪刀剪成4 mm左右的碎块，再用Hanks液清洗2～3次以除去血球和脂肪组织。将预处理过的人表皮组织放入培养瓶中，置于培养箱中孵育，待组织贴壁5 d后，换液(注意动作轻，避免组织脱落)；观察到细胞触角生出后，将组织块拿出，放入培养箱中继续培养；待细胞密度达到80%时，用Hanks液洗涤，弃上清，PBS缓冲液清洗2～3次后加入胰蛋白酶消化细胞并分瓶培养[14]。

1.2.3 人原代成纤维细胞的培养

采用含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素和体积分数为10%的FBS的 DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养人原代成纤维细胞，每隔2 d换液1次，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.4 rGO的表征

将浓度为1.0 mg·mL-1的rGO超声30 s后，吸取1滴，滴在200目的超薄铜网上，自然风干后用透射电子显微镜观察rGO的形貌特征。

1.2.5 CCK8法检测细胞活性

在人原代成纤维细胞生长至细胞密度达到80%时，用1 mL PBS缓冲液清洗后吸出，用2 mL胰蛋白酶消化后收集，重悬为单细胞悬液，用细胞计数板计数，按式(1)计算细胞密度(个·mL-1)：

(1)

根据计算出的细胞密度，配制密度为6×104个·mL-1的细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μL，即每孔细胞数为6 000个。96孔板周边培养孔中，加入100 μL PBS缓冲液以避免细胞培养过程中由于培养液蒸发导致的实验误差。将96孔板放入恒温细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长、每孔细胞密度达到80%时，分别给予不同浓度的rGO，继续培养至24 h后，移除孔板内培养基，每孔加入预先配制的100 μL CCK8溶液，置于恒温细胞培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度，按式(2)计算细胞活性：

(2)

式中：A为含有细胞、CCK8、rGO的溶液吸光度；A空白为仅含CCK8的溶液吸光度；A0为含有细胞、CCK8而不含rGO的溶液吸光度。

1.2.6 细胞划痕实验

用培养液将细胞密度调整为1×104个·mL-1， 接种于24 孔板中，每孔1 mL；待细胞贴壁生长24 h、细胞密度达到约80%时，弃培养液，用PBS缓冲液清洗3次；在孔板底部中央垂直划痕，PBS缓冲液清洗3次，去除多余的死细胞，用显微镜观察并拍照；采用随机数字表法分为对照组和rGO组(0、5、10、15、20、25、30、35、40，μg·mL-1)，将24孔板放入恒温培养箱中继续培养24 h后取出，弃培养液，用显微镜观察并拍照。

1.2.7 统计方法及数据处理

采用GraphPad Prism 5.0对实验数据进行统计学处理并作图，多个样本间的比较采用单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 rGO的表征

与GO比较，所制备的rGO的颜色更深，粉末更细，透射电子显微镜下呈现明显的薄层和典型的褶皱形态，如图1所示。

图1 rGO的TEM照片

2.2 人原代成纤维细胞的培养

按1.2.2提取人原代成纤维细胞，进行常规培养。培养至第10 d时，细胞开始慢慢从组织中伸出；培养至第15 d时，细胞开始伸出触角且数量越来越多，分布越来越密集，如图2所示。

图2 人原代成纤维细胞的显微镜照片(黑色部分为组织块)

2.3 rGO对人原代成纤维细胞活性的影响(图3)

*P<0.05

由图3可以看出，当rGO浓度小于5 μg·mL-1时，不影响人原代成纤维细胞的生长，细胞活性与rGO干预前相当；当rGO浓度为10～40 μg·mL-1时，细胞活性呈浓度依赖性降低。因此，5 μg·mL-1是rGO对人原代成纤维细胞的安全浓度。

2.4 细胞划痕实验结果(图4)

图4 细胞划痕实验结果

由图4可以看出，当rGO浓度小于5 μg·mL-1时，不影响人原代成纤维细胞的愈合；当rGO浓度大于5 μg·mL-1后，细胞愈合能力受到影响，且随着rGO浓度的增加，影响越来越明显。

本实验仅在体外初步研究了rGO对人原代成纤维细胞愈合的影响，在实际应用中还需要重点解决其毒性问题。目前关于rGO对皮肤的影响研究少见报道，今后可以更进一步研究rGO对皮肤的影响，探讨影响机制，发掘rGO对人类机体更多的生物作用。

3 结论

以GO制备的rGO颜色变深，粉末变细，具有明显的薄层和褶皱结构。以rGO溶液作用于人原代成纤维细胞，干预24 h后进行细胞活性检测和细胞划痕实验。结果表明，5 μg·mL-1是rGO对人原代成纤维细胞的安全浓度，浓度大于5 μg·mL-1后，细胞毒性随着浓度的增加逐渐增强；当rGO浓度小于5 μg·mL-1时，不影响人原代成纤维细胞的愈合。